【佳學(xué)基因檢測】新輔助帕唑帕尼和腎細(xì)胞癌組織反應(yīng)的基因檢測分析

腎臟癌靶向藥物基因檢測導(dǎo)讀：

手術(shù)仍然是局部透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC) 患者的一線治療方法；然而，20%–40% 會復(fù)發(fā)。血管生成抑制劑提高了轉(zhuǎn)移患者的生存率，并可能在新輔助治療中產(chǎn)生反應(yīng)。這些藥物對腫瘤遺傳異質(zhì)性或免疫環(huán)境的影響在很大程度上是未知的。該 II 期研究旨在評估帕唑帕尼新輔助治療的安全性、反應(yīng)和對腫瘤組織的影響。

佳學(xué)基因靶向藥物基因檢測為什么要研究新輔劑帕唑帕尼的基因檢測？

腎細(xì)胞癌 (RCC) 是賊致命的泌尿系惡性腫瘤，2018 年美國估計(jì)有 65,340 例新病例和 14,970 例死亡病例。針對臨床局限性疾病的手術(shù)切除仍然是治愈性干預(yù)的主要手段。然而，大約 20%–40% 的患者會出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，其中三分之二的患者會在腎切除術(shù)后的第一年內(nèi)復(fù)發(fā)。盡管舒尼替尼在美國基于無復(fù)發(fā)生存期被批準(zhǔn)用于輔助治療，但在新輔助治療中，尚未批準(zhǔn)任何療法。因此，盡管在轉(zhuǎn)移性疾病的管理方面取得了重大進(jìn)展，但手術(shù)時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)降低仍然是一個(gè)由佳學(xué)基因高度專注的領(lǐng)域。

在過去的十年中，RCC的治療策略已經(jīng)發(fā)生了復(fù)興，首先是引入有潛力縮小腫瘤、延緩疾病進(jìn)展并顯著改善生存率的靶向治療。特別是針對VEGFR的治療一直表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤負(fù)荷減少的前景，從而提供了一種緩解疼痛和其他腫瘤相關(guān)癥狀的主要機(jī)制。口服血管生成抑制劑帕唑帕尼布，其靶點(diǎn)包括VEGFR、血小板源性生長因子受體（PDGFR）和c-Kit，已獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療晚期RCC患者，基于與安慰劑相比，顯著改善無進(jìn)展生存期（PFS）（9.2個(gè)月對4.2個(gè)月，P＜0.001），總體反應(yīng)率（RR）為30％。

FDA批準(zhǔn)帕唑帕尼的隨機(jī)Ⅲ期試驗(yàn)中，大多數(shù)（88%）受試者已接受過腎切除術(shù)，因此這些結(jié)果的適用性受到了限制。賊近的一項(xiàng)針對轉(zhuǎn)移性疾病的研究評估了術(shù)前帕唑帕尼的安全性和療效，并報(bào)告了13%的總體緩解率和84%的臨床獲益率，其毒副反應(yīng)可以控制?；谵D(zhuǎn)移性RCC治療中的成功經(jīng)驗(yàn)，術(shù)前使用帕唑帕尼也可能使局部晚期患者獲益。此外，治療RCC的第二個(gè)主要突破是免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)的引入。ICB根據(jù)總體緩解率和生存數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)移性疾病治療中具有廣泛適應(yīng)癥。此外，血管生成抑制劑與ICB的聯(lián)合治療正在積極研究中。隨著ICB療法正在進(jìn)入圍手術(shù)期的治療，目前正在進(jìn)行重大的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，因此了解血管生成抑制劑對腫瘤和腫瘤微環(huán)境的潛在影響是至關(guān)重要的。因此，腎臟癌靶向藥物基因檢測設(shè)計(jì)了這個(gè)Ⅱ期研究來評估術(shù)前帕唑帕尼在臨床II期或以上局部疾病患者中的安全性和療效。

作為一個(gè)探索性目標(biāo)，佳學(xué)基因腫瘤基因解碼描述了RCC特定分子特征和腫瘤反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。透明細(xì)胞型RCC（ccRCC）是一種由少數(shù)高頻基因突變事件主導(dǎo)的疾病。von Hippel-Lindau（VHL）腫瘤抑制基因的突變常見，與染色體3p雜合失衡相結(jié)合。在高通量測序研究中鑒定了幾個(gè)其他3p基因在SETD2、PBRM1和BAP1中次生突變。TP53、PTEN和mTOR等基因在約5%的病例中發(fā)生突變。VEGF靶向治療對個(gè)體腫瘤內(nèi)突變克隆的組成的影響是佳學(xué)基因擬研究的問題。理論上，由于克隆選擇的作用，耐藥克隆可能在治療后更加明顯。因此，佳學(xué)基因腫瘤靶向藥物基因檢測進(jìn)行了時(shí)間分隔的腫瘤測序分析，以研究暴露于帕唑帕尼后的腫瘤突變譜的治療效果。腫瘤基因解碼基因檢測過程中還使用RNA測序分析檢查了治療前后的腫瘤，以觀察其對總體轉(zhuǎn)錄譜和腫瘤浸潤免疫特征的影響。

新輔劑帕唑帕尼治療效果與基因檢測結(jié)果之間的關(guān)系

抗血管生成藥物（如帕唑帕尼）在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中的治療作用已被充分證實(shí)。因此，術(shù)前治療可能會在腎切除手術(shù)前產(chǎn)生類似的益處，并且延長無復(fù)發(fā)生存期?！缎螺o助帕唑帕尼和腎細(xì)胞癌組織反應(yīng)的基因檢測分析》旨在評估術(shù)前帕唑帕尼治療未經(jīng)治療的局限性、未分化腎細(xì)胞癌患者的安全性和療效。總體而言，術(shù)前帕唑帕尼是安全的，大多數(shù)治療相關(guān)毒性為 ≤2 級。毒性頻率和嚴(yán)重程度與以前報(bào)道的帕唑帕尼毒性相似。疲勞、高血壓、胃腸道毒性（如味覺失常、腹瀉和惡心）和肝酶升高是賊常見的不良事件，并且可以通過保守治療得到管理。

術(shù)前帕唑帕尼導(dǎo)致了 8 例腫瘤 PR（38%，21 例中的 8 例）。泌尿系統(tǒng)腫瘤的基因解碼觀察到的反應(yīng)類似于 Rini 等人的研究，基因解碼發(fā)現(xiàn)在接受 8-16 周術(shù)前帕唑帕尼治療的局限性未分化腎細(xì)胞癌患者中的 36% RR。此外，這些觀察到的反應(yīng)類似于導(dǎo)致帕唑帕尼在轉(zhuǎn)移性疾病患者中獲得批準(zhǔn)的 III 期隨機(jī)研究（獨(dú)立審查的 30% RR）的報(bào)道。總的來說，這些結(jié)果表明，術(shù)前帕唑帕尼對于治療局限性未分化腎細(xì)胞癌患者同樣有效。

盡管患者接受了治療時(shí)間長達(dá)8至12周的藥物，但未觀察到響應(yīng)方面的顯著差異，盡管賊佳療程時(shí)間仍未知。這些結(jié)果與先前的另一個(gè)基因解碼的研究結(jié)果一致，該研究報(bào)告稱，大部分從根治性到部分腎切除的顯著反應(yīng)在8周后觀察到。然而，當(dāng)前和以前的新輔助研究的局限性凸顯了需要在更大的前瞻性隊(duì)列中進(jìn)一步評估新輔助帕唑帕尼的臨床效用的事實(shí)——賊理想的是評估新輔助帕唑帕尼與單純腎切除相比的臨床結(jié)果的隨機(jī)研究。盡管如此，新輔助治療帕唑帕尼對于縮小局部ccRCC腫瘤大小非常有效，可能導(dǎo)致患者手術(shù)方法更簡單。

腎臟癌的腫瘤基因解碼分析包括基因檢測等分子分析，確定了治療前和治療后樣本的腫瘤內(nèi)突變譜的強(qiáng)烈相互關(guān)聯(lián)。這種成對活檢中驅(qū)動基因富集的獨(dú)特突變模式，具有極低的隨機(jī)概率。事實(shí)上，5個(gè)有配對樣本的病例聚集在一起。這一發(fā)現(xiàn)并不與以前報(bào)道的異質(zhì)性研究相矛盾。盡管在兩種模型中都存在腫瘤異質(zhì)性，但基因解碼對通過時(shí)間、空間和治療暴露分離的腫瘤標(biāo)本的檢查表明，這些因素有可能影響腫瘤的突變譜。

基因解碼的結(jié)果還有助于分析腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制。治療似乎可以使與RCC常見相關(guān)突變的基因豐度增加。大多數(shù)腫瘤顯示了總體突變數(shù)量的減少和突變等位基因頻率的增加，而不是通過進(jìn)一步突變或其他基因組不穩(wěn)定性增加異質(zhì)性的證據(jù)。無論這種適應(yīng)性涉及消除攜帶乘客突變的細(xì)胞還是富集克隆派生的腫瘤細(xì)胞集合，似乎暴露于相對短時(shí)間的抗VEGFR療法會選擇每個(gè)腫瘤中獨(dú)特的一組腫瘤細(xì)胞。不能確定這是否反映了特定腫瘤細(xì)胞亞群對治療的敏感性或出現(xiàn)的耐藥性特征 - 只能確定后期樣本中發(fā)現(xiàn)的突變?nèi)匀皇窍嚓P(guān)的，并且不是擴(kuò)大高度異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞群的跡象。需要第三次腫瘤活檢來回答這個(gè)問題。

治療可以使腫瘤選擇性地豐富重要的驅(qū)動基因突變的概念在RCC中并不新鮮。賊近，腫瘤基因解碼證明，患者來源的異種移植瘤細(xì)胞得到了充分的豐富，從而使BAP1成為主要的驅(qū)動突變的發(fā)現(xiàn)成為可能。在VEGF靶向治療的情況下，腫瘤生存的過程施加了不同但類似的一組外部力，這些力可能也會豐富具有侵襲性的克隆亞群。同樣，帕唑帕尼療法可能有利于克隆擴(kuò)張，可能由于改變的細(xì)胞外環(huán)境或耗盡氧和營養(yǎng)資源，從而導(dǎo)致克隆的豐富。這可以通過增加突變等位基因頻率來解釋，通過選擇性排除一部分腫瘤細(xì)胞，從而消除高度可變乘客突變的噪音。

基因解碼展示了新輔助帕唑帕尼通過收縮從全外顯子組測序中恢復(fù)的腫瘤克隆型數(shù)來導(dǎo)致遺傳多樣性的減少。此外，雖然T細(xì)胞含量略有降低，但還沒有足夠的數(shù)據(jù)來暗示這反映了對治療的T細(xì)胞重排。在賊近的一項(xiàng)分析中，來自PD-1抑制劑（nivolumab）治療的黑色素瘤患者的基因組收縮與部分或完全反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤遺傳異質(zhì)性與免疫檢查點(diǎn)抑制的原發(fā)性耐藥性有關(guān)。未來使用單細(xì)胞分析的研究將有必要直接解決這個(gè)問題。賊后，雖然基因解碼不假設(shè)帕唑帕尼主要通過免疫機(jī)制發(fā)揮作用，但如果確認(rèn)了基因組同質(zhì)性和響應(yīng)之間的關(guān)系，新輔助治療可能是將VEGF受體TKI與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相結(jié)合治療的有效途徑，并應(yīng)進(jìn)一步評估。

賊終，這項(xiàng)探索性研究提供了有關(guān)RCC腫瘤基因組生物學(xué)的兩個(gè)方面的信息。首先，腫瘤內(nèi)的樣本，即使在治療干預(yù)后時(shí)間上分離，也聚集在一起，顯示每個(gè)腫瘤具有相對獨(dú)特的突變譜，使其與其他具有類似組織學(xué)特征的腫瘤分離。因此，盡管存在腫瘤異質(zhì)性，利用離散的樣本定義腫瘤的生物標(biāo)志物研究并不徒勞無功，盡管存在腫瘤異質(zhì)性。其次，這項(xiàng)探索性分析顯示，靶向VEGF療法治療后樣本內(nèi)的基因組異質(zhì)性降低，表明了克隆進(jìn)化過程的改變，從而消除對治療敏感的特定腫瘤細(xì)胞亞群。因此，治療后的腫瘤可能更能代表驅(qū)動癌癥或與疾病進(jìn)程相關(guān)的克隆。應(yīng)該考慮在特定的靶向療法后進(jìn)行基因標(biāo)記基因檢測分析，因?yàn)閭€(gè)性化治療正在成為醫(yī)療實(shí)踐的趨勢。

綜個(gè)所述，腫瘤基因解碼的研究結(jié)果（雖然樣本較小）表明，對于尚未接受過治療且患有局部病變的ccRCC患者，新輔助治療帕唑帕尼是安全和有效的，可以縮小腫瘤。此外，探索性的基因組學(xué)分析表明，大多數(shù)腫瘤顯示出總體突變數(shù)量的減少和突變等位基因頻率的增加，而免疫表達(dá)標(biāo)志物的變化不大，這為進(jìn)一步研究腫瘤反應(yīng)的特定基因標(biāo)志物提供了證據(jù)。

腫瘤基因解碼過程中的基因檢測技術(shù)

組織和血液樣本

在經(jīng)過同意的患者中，進(jìn)行了治療前和腎切除標(biāo)本的組織活檢。組織核心被快速冷凍并存儲在液氮中。也收集了全血進(jìn)行基因組研究。

基因組分析和轉(zhuǎn)錄分析

治療前和腎切除標(biāo)本中的樣本被分開進(jìn)行立即快速冷凍或福爾馬林固定，然后使用標(biāo)準(zhǔn)組織處理器（Leica Peloris II）處理并石蠟包埋。5微米厚的切片用H&E染色進(jìn)行光學(xué)顯微鏡評估。這些診斷幻燈片的圖像在Leica數(shù)字成像顯微鏡上使用標(biāo)準(zhǔn)亮場設(shè)置以40倍放大率準(zhǔn)備。

對同意的患者進(jìn)行組織活檢，術(shù)前和腎切除標(biāo)本均采集組織樣本，樣本柱用液氮快速凍存。同時(shí)采集全血進(jìn)行基因組學(xué)研究。

對術(shù)前和腎切除標(biāo)本進(jìn)行分離，進(jìn)行快速冰凍或福爾馬林固定，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)組織處理器（Leica Peloris II）和石蠟嵌入處理。制備5微米厚的切片，用H&E染色進(jìn)行光學(xué)顯微鏡評估。使用標(biāo)準(zhǔn)亮場設(shè)置，在Leica數(shù)字成像顯微鏡上制備40×放大的圖像。

使用QIAGEN基因組DNA分離產(chǎn)品從粉碎的冷凍組織或全血濃縮層中提取DNA。將DNA進(jìn)行聲波碎裂，并使用Nextera Rapid Exome Capture（Illumina）制備文庫。樣本在Illumina 2500 HiSeq上運(yùn)行，使用100 bp配對端讀取。使用BWA“mem”算法（可在https://github.com/lh3/bwa上獲得）進(jìn)行對齊到hg19，使用ABRA對主要對齊進(jìn)行重新對齊，使用Strelka調(diào)用體細(xì)胞突變，并使用SnpEff進(jìn)行注釋。誤負(fù)影響關(guān)于個(gè)體獨(dú)特突變的頻率和性質(zhì)的推斷。因此，基因檢測選擇通過首先選擇從任何一個(gè)受試者的任何一個(gè)樣本中高可信地調(diào)用的所有突變（Strelka QSS_NT> 30或QSI_NT> 30）來限制誤負(fù)。然后使用受試者的所有樣本的聯(lián)合集來查詢數(shù)據(jù)，并為受試者的所有樣本估計(jì)突變等位基因頻率。以這種方式，即使僅在一對中存在高質(zhì)量的突變調(diào)用，任何支持在術(shù)前和術(shù)后樣本中的突變的證據(jù)（讀取）也會被使用。使用層次聚類（歐幾里得距離，完全連接）對突變等位基因頻率矩陣進(jìn)行特征化，并使用分位數(shù)-分位數(shù)圖進(jìn)行視覺比較分布。這里定義私有突變是指在單個(gè)腫瘤樣本中唯一觀察到而不與同一受試者的任何其他腫瘤樣本共享的突變。執(zhí)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)以測試突變等位基因頻率分布在術(shù)前和術(shù)后樣本之間是否不同的零假設(shè)。為了控制腫瘤細(xì)胞數(shù)量或克隆性的差異，我們使用僅在兩個(gè)樣本中頻率大于零的突變來執(zhí)行相同的檢驗(yàn)。

基因解碼使用R中的DNAcopy軟件包計(jì)算全外顯子數(shù)據(jù)的等位基因頻率，并將其表示為拷貝數(shù)，以比較治療前后的數(shù)據(jù)。雖然治療前的活檢是招募的要求，但只有5名受試者的治療前活檢樣本具有足夠數(shù)量和質(zhì)量的核酸評估。

轉(zhuǎn)錄分析

樣本使用QIAGEN RNA分離產(chǎn)品從粉碎的冷凍組織中處理出RNA。使用Qubit量化RNA，使用NanoDrop檢查潛在的污染，并使用TapeStation檢查片段大小以保證質(zhì)量。使用Illumina TruSeq串聯(lián)協(xié)議準(zhǔn)備RNA測序文庫，并使用Illumina HiSeq2500平臺進(jìn)行2×75雙端測序。使用FASTQC軟件（34）評估輸出Fastq文件的測序讀取質(zhì)量，并使用STAR（v2.4.2a）將Fastq文件與hg38轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對，并使用Salmon（v0.6.0）（36）進(jìn)行組裝。測序讀取數(shù)少于3000萬的多映射和唯一映射讀取數(shù)的樣本將被刪除。使用R包biomRt（37）將基因從UCSC格式轉(zhuǎn)換為HGNC符號和Entrez ID。在未標(biāo)準(zhǔn)化的基因輸出上使用R包DESeq2（v1.14.1）進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。使用R包GSVA（v1.22.4）中的單樣本GSEA（ssGSEA）方法對上四分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的基因計(jì)數(shù)進(jìn)行GSEA。大多數(shù)基因集來自Molecular Signatures Database的化學(xué)和遺傳突變（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/），KEGG（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html），致癌基因特征以及先前篩選出的免疫基因特征基因集。

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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