【佳學(xué)基因檢測】易栓癥基因檢測:一個(gè)家庭受益的案例
資深臨床醫(yī)師如何看待易栓癥基因檢測?
血栓癥就是高血栓形成傾向。血栓形成傾向是一種多因素疾病,涉及環(huán)境因素和遺傳因素。通過基因解碼所明確的導(dǎo)致血栓形成傾向相關(guān)先天性疾病傾向的因素包括抗凝血酶缺乏、蛋白C和蛋白S缺乏、凝血因子V Leiden突變、凝血酶原異常和抗磷脂綜合征。心血管疾病致病基因鑒定基因解碼揭示了在中國的一個(gè)家庭中,編碼凝血因子II(即凝血酶)的F2基因突變與血栓形成傾向風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián),該家庭中有四名成員(I-2、II-2、II-3和III-1)有深靜脈血栓栓塞史。致病基因鑒定基因解碼通過實(shí)驗(yàn)室檢測和計(jì)算機(jī)斷層血管造影術(shù)對該家庭的疾病進(jìn)行了評估。為了確定導(dǎo)致血栓形成傾向風(fēng)險(xiǎn)增加的基因原因及該病的遺傳力,采用全外顯子組測序技術(shù)對兩名患者(II-2和III-1)進(jìn)行了分析。在兩名受影響個(gè)體中分別觀察到的2222和2203個(gè)遺傳變異中,經(jīng)篩選和Sanger測序確認(rèn)后,發(fā)現(xiàn)了一種外顯子錯(cuò)義F2突變T165M(NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896)。I-2、II-3和III-1與先證者(患者II-2)都具有這一突變,而II-6則為該突變的雜合子形式。在正常對照組中未檢測到這種有害突變。本基因檢測項(xiàng)目明確了家族成員患病的共同原因,結(jié)合生相關(guān)生育技術(shù)可以阻斷該病在家族中的傳播。
易栓癥的基因解碼
易栓癥是高度血栓形成傾向?;蚪獯a揭示其是一種血液凝固障礙,以易于形成血栓為特點(diǎn),并導(dǎo)致不良血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)增加,包括深靜脈血栓栓塞(DVT)和肺栓塞(PE)。血栓形成傾向的風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳和環(huán)境原因。已有的基因解碼表明,血栓形成傾向是由蛋白質(zhì)分化或功能缺陷引起的,包括蛋白質(zhì)C和S的缺乏,以及已確定的約8種人類基因突變作為致病原因。然而,血栓形成傾向的遺傳原因在基因解碼的基礎(chǔ)上得以進(jìn)一 步增加。一名52歲的漢族男性因反復(fù)性DVT被轉(zhuǎn)診至佳學(xué)基因合作醫(yī)療機(jī)構(gòu),其新穎因DVT住院發(fā)生在2001年。經(jīng)過治療后,患者康復(fù)。2003年,該患者因PE再次入院,并在人民醫(yī)院置入下腔靜脈濾器以防止進(jìn)一步的PE。通過實(shí)驗(yàn)室檢測和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)血管造影術(shù),患者的疾病被診斷為血栓癥。分析了可能參與其疾病發(fā)生的因素。為了調(diào)查可能的潛在原因,采用了全外顯子組測序(WES)技術(shù)及基因解碼來排除疾病發(fā)生的基因原因,并鑒定出F2基因的突變。未檢測到凝血因子V Leiden突變或凝血酶原G20210A突變。
F2基因位于染色體區(qū)域11p11-q12,跨越20.3kb。該基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成凝血因子II,即凝血酶(462個(gè)氨基酸),它參與人類血液凝固的賊后階段并控制凝血酶原的合成。F2突變導(dǎo)致各種形式的血栓形成和凝血酶原異常。
佳學(xué)基因檢測在患病家族的同意下,招募了一個(gè)患有血栓形成傾向的漢族家庭。該家庭包括11名健在成員(包括先證者及受影響個(gè)體II-3、III-1),并選取了100名正常的漢族獻(xiàn)血者作為對照。正常獻(xiàn)血者的年齡范圍(35至60歲)和性別比例(50名男性,50名女性)與患有該疾病的II-2、II-3、III-1患者的選擇相匹配,且他們的年齡分別為52歲、50歲和32歲。血栓形成傾向的診斷基于典型的臨床和實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果,并通過CT血管造影術(shù)(CTA)進(jìn)行確認(rèn)。從所有研究參與者中采集抗凝管中的外周血,并按照標(biāo)準(zhǔn)程序,使用酚-氯仿法從家庭成員和正常獻(xiàn)血者的白細(xì)胞中提取基因組DNA。
圖1:受試者的計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影圖像。箭頭表示下腔靜脈濾器。
全外顯子組測序(全外顯子測序)
利用全外顯子組測序(WES)技術(shù)對先證者及其兒子(III-1)的DNA進(jìn)行測序。對約26,000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子進(jìn)行測序,同時(shí)對具有血栓癥(血檢形成傾向)患者和健康個(gè)體的基因突變序列進(jìn)行比對。使用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0試劑盒(Roche Diagnostics,美國印第安納波利斯)捕獲每個(gè)樣本的編碼序列,并將每個(gè)捕獲的文庫加載到Solexa Hiseq2000平臺(tái)(Illumina,美國圣地亞哥)上進(jìn)行序列分析。使用Covaris S2系統(tǒng)(Covaris Inc.,美國馬薩諸塞州沃本市)對兩名受影響個(gè)體的基因組DNA樣本進(jìn)行片段化。然后將DNA Library Prep Reagent Set(New England Biolabs Inc.,美國)中的接頭連接到所得片段的兩端。通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增捕獲的片段,隨后進(jìn)行測序。
突變序列定位與基因解碼分析
參與者的全外顯子組測序(WES)是從血液中提取的基因組DNA進(jìn)行的,并通過佳學(xué)基因高通量基因測序及基因解碼平對啊進(jìn)行分析。使用Burrows-Wheeler Aligner將所有的測序的區(qū)域定位到與人類參考基因組。使用SOAPsnp軟件包和SOAP denovo分別檢測合并BAM文件中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及插入或缺失(indels)。(http://www.soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)。
候選SNP的篩選與標(biāo)記
使用以下分析參數(shù)對候選SNP進(jìn)行篩選和標(biāo)記:i) SNP質(zhì)量得分大于20;ii) 測序深度不低于4倍;iii) 兩個(gè)SNP之間的距離大于5個(gè)堿基對;iv) 估計(jì)的拷貝數(shù)小于2。
圖2:先證者的計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影圖像顯示了肝硬化和脾腫大。(紅色箭頭指示先證者的肝腫塊,白色箭頭指示脾臟)。
候選基因驗(yàn)證
候選突變通過高通量測序獲得后,佳學(xué)基因進(jìn)一步采用諾貝爾獲獎(jiǎng)技術(shù)Sanger測序驗(yàn)證WES的高效性,以確認(rèn)候選基因的突變。使用的PCR引物為正向5′-TGTGAACATCACCCGGTCAG-3′和反向5′-GACTGACGCCAGCTCTGAAG-3′,設(shè)計(jì)用于驗(yàn)證T165M基因中的候選突變。結(jié)果與WES識別的候選突變一致。此外,還通過以下方法驗(yàn)證了WES結(jié)果的高效性:i) 家族內(nèi)驗(yàn)證,在每個(gè)家庭成員的基因組中觀察到表型和基因型的共分離突變;ii) 在100名正常獻(xiàn)血者中進(jìn)行驗(yàn)證,確認(rèn)在正常獻(xiàn)血者中未觀察到表型和基因型的共分離突變。此外,使用ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對凝血因子II的跨物種氨基酸進(jìn)行了比較。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取F2的氨基酸序列,然后輸入到ClustalW2中。ClustalW2的結(jié)果顯示了所選序列的賊合適匹配,并以一種易于識別和理解的方式對齊了它們的同一性、相似性和差異性。
基因解碼結(jié)果找到了家族中血栓傾向患者的臨床特征
已知增加血栓事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的遺傳因素包括蛋白C和蛋白S缺乏。此外,因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變、因子VIII、IX或XI水平升高、同型半胱氨酸和纖維蛋白原也可能是血栓事件的危險(xiǎn)因素。通過佳學(xué)基因合作醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室檢測和CT血管造影,證實(shí)了患者的易栓癥的臨床診斷。分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、一期凝血試驗(yàn)和單克隆抗因子XI捕獲抗體測定因子VIII、IX和XI的水平。采用多克隆酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定蛋白C和蛋白S,采用STAGO自動(dòng)凝血儀進(jìn)行凝血研究。患者的凝血因子及蛋白C和S水平均正常。然而,先證者及其他受累家族成員的纖維蛋白原水平異常。觀察到他們的活化部分凝血活酶時(shí)間和血漿凝血酶原時(shí)間延長。血漿免疫反應(yīng)性纖維蛋白原水平也較低。
全外顯子組測序確定F2為候選基因
對先證者及其兒子(II-2和III-1)的外顯子組進(jìn)行了捕獲和測序。按照之前描述的測序和過濾步驟后,為兩名受累個(gè)體確定了候選變異體??傮w而言,外顯子組實(shí)現(xiàn)了高覆蓋率,為兩名受累個(gè)體分別產(chǎn)生了9300萬和9900萬條測序讀段,分別覆蓋了73億和74億個(gè)堿基。其中,約90.7%的讀段與人類參考基因組比對成功,60.5%的讀段落在靶向和富集的外顯子上。靶向外顯子的平均測序深度為84倍。在該家族的兩名受累個(gè)體中,分別鑒定出101,037和97,227個(gè)遺傳變異,包括非同義突變、剪接受體和剪接供體位點(diǎn)變異以及插入/缺失(indels)。此外,這些II-2和III-1的變異體還通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)dbSNP構(gòu)建版132(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)、SIFT(http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html.)和PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)進(jìn)行了進(jìn)一步評估。SIFT和PolyPhen2程序用于蛋白質(zhì)分析,其應(yīng)用過程符合之前描述的分析方案。經(jīng)過這一過濾步驟后,僅在候選區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)變異體(NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896)。該變異體是一個(gè)之前在其他漢族人群研究中未被觀察到的純合子錯(cuò)義突變,但在新疆哈薩克族人群中,該變異體被報(bào)道為與血栓傾向相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。
Sanger測序
為了驗(yàn)證全外顯子組測序(WES)的結(jié)果,采用Sanger測序分析了該家族中F2基因的候選突變(T165M)。結(jié)果顯示,Sanger測序進(jìn)一步證實(shí)了候選變異體(T165M)的存在,排除了假陽性的可能性。多方法驗(yàn)證,高效了檢測結(jié)果的正確性。
圖3: 一個(gè)患有血栓傾向(thrombophilia)的家族的家系圖
T165M的為什么是致病基因?基因解碼進(jìn)一步明確
根據(jù)《人體致病基因集及其結(jié)構(gòu)功能分析》,F(xiàn)2的結(jié)構(gòu)與人類凝血酶原相似。受影響的氨基酸(T165M)位于第6外顯子,導(dǎo)致第165位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?。先前的研究已揭示,?外顯子及其側(cè)翼區(qū)域具有高度多態(tài)性。然而,通過ClustalW2將受影響的人、小鼠、猩猩、兔子、大鼠、牛、綿羊、馬、豬、熱帶爪蟾和黑猩猩基因組中的氨基酸序列及其側(cè)翼區(qū)域(殘基145-185)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)T165M位于F2的一個(gè)高度保守區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步說明該基因序列的正常對健康維護(hù)的重要性。
易栓癥基因檢測的重要意義
在易栓癥的致病基因查找及其遺傳性的分析判定中,采用CT血管造影和臨床試驗(yàn)對家族內(nèi)的血栓傾向進(jìn)行了診斷。CT血管造影已成為評估深靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的有用診斷成像方法,且比其他成像方式更為有效,特別是對于縱隔和實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估。能夠可視化先證者體內(nèi)下腔靜脈濾器的位置、脾腫大和肝硬化。實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果可能表明該家族血栓傾向風(fēng)險(xiǎn)增加的根本原因。值得注意的是,在先證者中未檢測到因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變。潛在原因可能是血液凝固成分異常,這可能影響凝血酶介導(dǎo)的機(jī)制以及凝血和抗凝過程。
易栓癥致病基因鑒定基因解碼利用全外顯子組測序(WES)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這一家庭可能的F2變異體與血栓傾向潛在分子機(jī)制之間的關(guān)聯(lián),并揭示T165M突變是疾病發(fā)生的原因,其遺傳性遵循孟德爾遺傳規(guī)律?;蚪獯a進(jìn)一步明確,如果家族成員是變異的雜合子基因型不會(huì)形成血栓癥,而純合子具有血栓形成高風(fēng)險(xiǎn)。
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