【佳學基因檢測】基因檢測揭秘：埃勒斯-當洛綜合征（EDS）及其血管型的遺傳奧秘

埃勒斯-當洛綜合征基因檢測導讀：

埃勒斯-當洛綜合征（EDS）是一組異質(zhì)性的結(jié)締組織疾病。它的特點是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的分子異常，如膠原蛋白或其修飾酶。EDS的臨床特征包括皮膚超彈性、大關節(jié)過度活動以及容易淤青。基于臨床經(jīng)驗和遺傳發(fā)現(xiàn)，EDS被分為六個亞型（1997年維爾夫蘭分類）：（1）經(jīng)典型，這是最常見的形式；（2）過度活動型；（3）脊柱后凸側(cè)凸型；（4）關節(jié)松弛型；（5）皮膚松弛型；以及（6）血管型，這是最具戲劇性的形式。EDS亞型的遺傳和臨床發(fā)現(xiàn)指出了EDS綜合征的遺傳異質(zhì)性。因此，正確診斷EDS類型對遺傳咨詢和管理具有重要意義。EDS的任何亞型都需要特定的生化和基于基因解碼的分子檢測來支持。

血管型EDS（vEDS），也稱為EDS IV型（NIM#130050），是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，估計患病率為1/150,000。血管型EDS有四個主要特征：（1）血管或內(nèi)臟器官（如子宮和腸道）的破裂，（2）不尋常的面部外觀，（3）容易淤青，以及（4）皮膚透明，可見靜脈。在vEDS中，一個重要的臨床事件是富含III型膠原蛋白的系統(tǒng)動脈可能發(fā)生剝離、動脈瘤或破裂。這些嚴重事件也可能自發(fā)發(fā)生。

vEDS的遺傳原因是III型膠原蛋白α1基因（COL3A1）中存在突變，導致成熟III型膠原蛋白蛋白的定性和/或定量異常。III型前膠原蛋白蛋白的每個氨基酸鏈中都包含343個甘氨酸（Gly）-X-Y重復序列（X和Y為任何其他氨基酸）。成熟的III型膠原蛋白纖維由3條α-1(III)鏈組成

埃勒斯-當洛綜合征基因檢測案例介紹

一名38歲的河南女性患者，此前已被診斷為血管型埃勒斯-當洛綜合征（vEDS），來到致病基因鑒定基因解碼位于佳學基因檢測合作醫(yī)院就診。她曾因乙狀結(jié)腸-直腸缺血性穿孔伴糞性腹膜炎接受了乙狀結(jié)腸-直腸切除術和造口術?；颊邿ovEDS家族史。在她26歲時，尚未被臨床診斷為EDS，她接受了雙足內(nèi)弓矯正和跗骨竇關節(jié)融合術的正骨手術。

致病基因鑒定基因解碼采用下一代測序（NGS）技術，通過目標富集技術調(diào)查感興趣的基因組區(qū)域；該過程使用HaloPlex目標富集試劑盒（Agilent Technologies）進行。設計中包括的九個基因是根據(jù)其臨床特征選擇的。實際分析的靶標總區(qū)域大小為100,336千堿基對（kbp），實際分析的佳靶標堿基為99,718 kbp。根據(jù)供應商提供的實驗方案進行富集。在37°C下，使用八種不同的限制反應對總共225納克（ng）的DNA進行30分鐘的消化。將八種消化反應合并為一個含有特異性靶標探針的雜交混合物。在54°C下進行3小時的雜交反應。探針用生物素標記，并設計為與消化片段的兩端雜交，從而生成包含一個缺口的環(huán)狀片段。然后，使用鏈霉親和素珠捕獲DNA探針雜交體，以消除線性非靶標DNA片段。在第二次連接反應中，剩余的缺口被封閉以完成環(huán)化。從珠子上洗脫捕獲的DNA，并通過聚合酶鏈反應（PCR）進行擴增。

最后，通過TapeStation軟件測量了每個文庫的濃度，并使用TE將其稀釋至4nmol。通過將不同的基因組文庫混合，獲得了最終文庫池，理想的最終濃度為8 pM（集群密度約為900/1000 K/mm²的理想濃度）。捕獲的基因組文庫通過Illumina MiSeq進行測序，生成了2×150 bp的配對末端讀數(shù)。

為了理解生成的FASTQ文件（一種存儲生物序列及其質(zhì)量分數(shù)的文件）。通過Burrows-Wheeler Aligner對FASTQ文件進行質(zhì)量評估、修剪、對齊，并映射到人類參考基因組（GRCh38/hg38）。使用SAM工具對包括排序、合并、索引和生成每個位置格式的對齊在內(nèi)的對齊操作進行處理，以生成BAM文件（用于存儲序列的二進制格式）。使用Genome Analysis Toolkit (GATK) 2.0版（美國馬薩諸塞州劍橋市Broad Institute）進行局部重新對齊、堿基質(zhì)量重新校準和變異調(diào)用，并應用以下質(zhì)量參數(shù)：覆蓋率>20，堿基質(zhì)量分數(shù)>30，映射質(zhì)量>20。未通過這些質(zhì)量值的變異被移除。

最后，使用KGGSeq軟件通過不同的參數(shù)（如基因型質(zhì)量過濾器、基因特征過濾器（錯義、剪接、移碼）和功能影響過濾器）對變異調(diào)用文件（VCF）進行過濾。通過Sanger方法使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，Life Technologies）對通過NGS目標富集方法發(fā)現(xiàn)的變異進行確認，隨后在Applied Biosystems 3130xl上進行毛細管電泳。使用Sequencher軟件v5.1分析電泳圖。

使用致病基因鑒定基因解碼的定制面板（表1）通過目標富集方法進行重測序，結(jié)果顯示COL3A1基因第21號外顯子1493位存在一個未被基因檢測數(shù)據(jù)庫收錄突變，導致核苷酸替換（c.1493G>A，p.G498D）。這一突變在第二次DNA提取中通過Sanger方法得到了確認。此外，由于患者臨床狀態(tài)極度虛弱，從成纖維細胞培養(yǎng)中提取互補DNA（cDNA）進行分析并不可行。

COL3A1基因編碼的III型前膠原蛋白由每個三肽鏈中的343個Gly-X-Y重復序列（X和Y為任何其他氨基酸）組成，這是膠原蛋白特異性的一個特征。成熟的III型膠原纖維由3條α-1(III)鏈組成。COL3A1基因一個等位基因上的突變導致成熟III型膠原蛋白出現(xiàn)質(zhì)量或數(shù)量上的異常（圖2）[16]。為了評估該突變的功能效應，致病基因鑒定基因解碼使用SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2和Align GVGD進行了計算機模擬分析；所有這些工具均預測這一變化將導致疾病發(fā)生。

圖2顯示，c.1493G>A，p.G498D是一個錯義變異，導致從中性氨基酸甘氨酸（Gly）到極性氨基酸天冬氨酸（Asp）的替換，且該變異位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三螺旋區(qū)域。

為了研究錯義變異的致病特性，使用了不同類型的軟件：SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2、Mutation Taster、Grantham距離等。這些工具通過評估變異對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能或穩(wěn)定性的潛在影響，幫助確定變異是否具有致病性。通過綜合這些分析結(jié)果，可以進一步了解變異的生物學意義和潛在的臨床影響。

基于兩個數(shù)據(jù)集（人類多樣性和人類變異）的PolyPhen-2軟件預測表明，c.1493G>A，p.G498D對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能具有破壞性，得分為1.000（敏感性0.00；特異性1.00；圖3）。特別是，第1493位的甘氨酸（Gly）在不同物種中高度保守。SIFT和PROVEAN軟件評估了氨基酸替換是否對蛋白質(zhì)的生物學功能有影響，并證實了該錯義變異的致病性。Align GVGD則根據(jù)氨基酸的生物物理特性預測，該變異是不被容忍的C65（GV 0.00；GD 93.77；圖3）。由于目前尚無序列同源性參考來構(gòu)建該結(jié)構(gòu)，因此無法分析該突變對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的影響。

埃勒斯-當洛綜合征基因檢測案例總結(jié)

在《心血管系統(tǒng)疾病及基因檢測病案集》報告中，致病基因鑒定基因解碼描述了一名38歲河南女性的病例，她具有血管型埃勒斯-當洛綜合征（vEDS）的典型癥狀。她因乙狀結(jié)腸-直腸缺血性穿孔伴糞性腹膜炎接受了乙狀結(jié)腸-直腸切除術和造口術。為避免手術并發(fā)癥，造口術并未關閉。她的腸道問題加劇了她的臨床狀況。體格檢查顯示，她的皮膚略顯光滑且半透明，可見靜脈。遺傳分析未確認任何家族史。

通過使用基于基因解碼的目標下一代測序（NGS）方法，致病基因鑒定基因解碼在COL3A1基因中發(fā)現(xiàn)了一個致病性突變c.1493G>A，p.G498D（http://www.le.ac.uk/ge/collagen/）。迄今為止，已在COL3A1基因中鑒定出200多種突變，所有這些突變都導致異常III型前膠原蛋白的合成（圖1）。大約三分之二的突變是單核苷酸替換，導致前α1(III)鏈三螺旋結(jié)構(gòu)域中的甘氨酸殘基發(fā)生改變。其余大部分為剪接位點突變，導致外顯子跳躍，盡管其中一些具有更復雜的后果，且少數(shù)為較大的基因組缺失。突變的性質(zhì)或位置與主要并發(fā)癥的類型或頻率之間無相關性。

在COL3A1基因中檢測到雜合子突變c.1493G>A，導致中性氨基酸甘氨酸被極性氨基酸天冬氨酸取代。PolyPhen-2、SIFT、PROVEAN和Align GVGD進行的薈萃分析表明，該點突變是致病性的，并且是vEDS表型的原因。甘氨酸的替代對COL3A1膠原纖維的正常組裝產(chǎn)生負面影響。事實上，膠原的特征在于Gly-X-Y（X和Y為任何其他氨基酸）的343次重復。甘氨酸氨基酸非常重要，因為它是最小的氨基酸，并決定了前α鏈之間通過氫鍵連接的緊密性，從而維持了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

致病基因鑒定基因解碼得出結(jié)論，COL3A1基因中發(fā)現(xiàn)的c.1493G>A，p.G498D是vEDS（血管型埃勒斯-當洛斯綜合征）的原因。甘氨酸替換的特定位置表明基因型與表型之間存在相關性。c.1493G>A，p.G498D的功能特性尚不清楚，需要進一步的體外細胞培養(yǎng)研究來了解這一新變異與vEDS表型之間的聯(lián)系。在vEDS中發(fā)現(xiàn)這一新變異強調(diào)了基因測試（如NGS）在罕見遺傳性疾病中的重要性。

圖3：數(shù)據(jù)分析。PolyPhen-2 預測表明 c.1493G>A (p.G498D) 可能破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（基于兩個不同的數(shù)據(jù)集人類多樣性和人類變異）。b Align GVGD 表明 c.1493G>A (p.G498D) 是有害的（類別 65）