【佳學(xué)基因檢測】北京非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測

遺傳病基因檢測關(guān)于疾病的介紹

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是全球最常見的先天性出生缺陷之一。根據(jù)《基因檢測可以阻斷遺傳的遺傳病》，每1000個新生兒就會有一例非綜合征性唇腭裂。非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P可分為五種類型——（A）唇裂及牙槽裂，（B）腭裂，（C）不完全單側(cè)唇裂合并腭裂，（D）完全單側(cè)唇裂合并腭裂，（E）完全雙側(cè)唇裂合并腭裂——。佳學(xué)基因采用基因解碼發(fā)現(xiàn)，這些類型均由人類胚胎發(fā)育第4到第10周間間充質(zhì)組織在細胞遷移、增長、分化和凋亡中的異常造成。盡管這類畸形不是主要的死亡原因，但其對健康的終身影響以及對患者和家庭造成的巨大的經(jīng)濟和社會負擔(dān)，使其治療具有一定的困難。以往研究表明，非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因具有異質(zhì)性，且與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)。然而，在遺傳性非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中，單基因突變可能具有更重要的意義。關(guān)于非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中共享相關(guān)突變基因的研究較少。因此，識別易感變異在非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的預(yù)防、治療和預(yù)后中具有重要作用。

全基因組測序（WGS）和全外顯子測序（WES）是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中最廣泛使用和有效的基因組學(xué)方法，這些方法能夠更全面地識別單核苷酸變異（SNV）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失突變（INDEL）、拷貝數(shù)變異（CNV）和結(jié)構(gòu)變異（SV）。全基因組測序?qū)λ谢蜻M行測序，檢測外顯子、內(nèi)含子和調(diào)控序列，篩選基因組中的遺傳變異，支持基因型多樣性分析、遺傳進化分析、疾病發(fā)病機制研究和易感基因篩查。WGS在各種疾病的研究、篩查和監(jiān)測中越來越多地被應(yīng)用。致病基因鑒定基因解碼使用WGS識別了基因與疾病之間的關(guān)聯(lián)，基因檢測機構(gòu)通過WGS發(fā)現(xiàn)了高風(fēng)險兒童癌癥的可操作靶點。全外顯子測序（WES）是一種更高效、完整、特異且經(jīng)濟的測序技術(shù)，用于研究遺傳性疾病的病因。佳學(xué)基因等通過WES識別了非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P中的變異基因，發(fā)現(xiàn)易感基因不僅有助于揭示非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因，還幫助診斷和治療非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者。許多基因解碼探討了非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的成因。這些基因解碼基因檢測表明，由于不同的遺傳背景，不同人群可能有不同的致病變異?！洞诫窳训闹虏』蜩b定基因解碼》總結(jié)了與出生缺陷病因相關(guān)的多種基因。有關(guān)中國人群非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相關(guān)基因組位點突變的深入分析是佳學(xué)基因解碼的重點關(guān)注課題

這一基因解碼基因檢測的病例分析通過測序技術(shù)對南方中國一個家庭中與非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相關(guān)的de novo RESP18 rs2385404和rs2385405基因多態(tài)性進行了基因組分析。我們的發(fā)現(xiàn)為非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因提供了重要的見解。
 

非綜合征唇腭裂遺傳病材料與方法

參與者

佳學(xué)基因檢測從廣州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院所送檢測的一個由5人組成的遺傳性非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族。成人及兒童的父母/監(jiān)護人均提供了遺傳病基因檢測的知情同意。邀請了三名具有主治醫(yī)師資格的整形外科醫(yī)生進行臨床檢查和診斷。進行了全面的身體檢查，以排除其他器官畸形、畸形，根據(jù)臨床特征診斷為唇腭裂CL/P?？紤]到來自同一遺傳家族的5名受試者生活在相同環(huán)境中，因此在分析時認為5名患者的生活環(huán)境是相同的。整個基因檢測分析符合醫(yī)學(xué)倫理審查部的審查。

佳學(xué)基因檢測從每位參與的家庭成員處獲得了臨床信息和外周血樣本。五名成員參與了研究（見圖1，黑色虛線矩形）。其中三名成員有完全唇裂合并腭裂，另外兩名為正常對照（正常1和正常2）。父母分別為II3（Cleft 1）和II4（Cleft 2），兩人均有單側(cè)完全唇裂合并腭裂，而III2（Cleft 3）為有雙側(cè)完全唇裂合并腭裂的兒子。

• II3、II4 和 III2 是表現(xiàn)出 NSCLP 表型的個體（即患者）。
• I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4 是家系中沒有 NSCLP 表型的成員。
• II3、II4、III2、III3 和 III4 分別代表 Cleft_1、Cleft_2、Cleft_3、Normal_1 和 Normal_2。
• 黑色符號 表示受影響的成員。
• 箭頭 指向家系圖中的 proband（研究的起始個體）。
• 五名成員 參與了研究，這些成員在 圖 1 中的黑色虛線矩形 內(nèi)標(biāo)出。

說明：

1. 具有 NSCLP 的家族成員：

   • II3、II4 和 III2 是表現(xiàn)出非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）表型的個體，說明這些人有該病，但沒有其他綜合征或先天性異常。

2. 沒有 NSCLP 的家族成員：

   • 其他列出的家族成員（I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4）則沒有表現(xiàn)出 NSCLP 表型。

3. 家系圖中的標(biāo)記：

   • 黑色符號 代表家系中患有 NSCLP 的成員。
   • 箭頭 指向 proband（研究起始個體），這個個體是研究的主要關(guān)注對象。
   • 五名參與者 被標(biāo)出在家系圖的 黑色虛線矩形 內(nèi)，表示他們參與了該研究。

基因檢測幫助下的家庭情況

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）家系的臨床表現(xiàn)：

• (A) (II3) 和 (B) (II4) 是擁有單側(cè)完全唇裂和腭裂的父母，他們在手術(shù)后恢復(fù)情況。
• (C) (III2) 是有雙側(cè)完全唇裂和腭裂的兒子，他在手術(shù)前的情況。
• (D) 顯示了 proband（研究的起始個體）手術(shù)后1年的臨床特征。

說明：

1. 家族成員的臨床表現(xiàn)：

   • (II3) 和 (II4) 作為父母，均有單側(cè)完全唇裂和腭裂，并在手術(shù)后恢復(fù)了健康。手術(shù)后的恢復(fù)情況顯示他們的病情得到了改善。
   • (III2) 是他們的兒子，在手術(shù)前患有雙側(cè)完全唇裂和腭裂，說明他的病情比父母更為嚴(yán)重。
   • (D) 中的圖像展示了研究個體（proband）在手術(shù)后1年的臨床特征，提供了關(guān)于手術(shù)效果和恢復(fù)情況的重要信息。

2. 基因檢測的幫助：

   • 了解遺傳因素：基因檢測可以幫助確認是否存在遺傳性因素導(dǎo)致 NSCLP，從而提供更多關(guān)于家族成員病情的背景信息。
   • 制定個性化治療方案：基于基因檢測的結(jié)果，醫(yī)生可以為每位家庭成員制定個性化的治療和康復(fù)計劃，以提高治療效果。
   • 評估遺傳風(fēng)險：通過基因檢測，家族成員可以了解自己是否攜帶相關(guān)的遺傳變異，幫助預(yù)測后代的遺傳風(fēng)險，制定相應(yīng)的預(yù)防和干預(yù)措施。

總體而言，基因檢測能幫助確定家族中非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）的遺傳基礎(chǔ)，為家族成員提供科學(xué)的遺傳風(fēng)險評估，并優(yōu)化個體化治療方案。

全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）由佳學(xué)基因醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司（中國北京，npz842.cn）執(zhí)行?；蚪MDNA從患者的外周血中提取。使用RNA 6000 Nano LabChip試劑盒（Agilent，CA，美國）確保基因組DNA樣品質(zhì)量高，OD 260/280比率為1.8–2.0。使用高靈敏度DNA芯片試劑盒（Agilent，CA，美國）和Agilent SureSelect Human All Exon V6（Agilent，CA，美國）構(gòu)建的DNA文庫進行了測序，并在Illumina HiSeq2500/4000測序平臺上運行。

在比對步驟中，測序讀取通過Burrows-Wheeler比對器（BWA，牛津，英國）與參考基因組（UCSC基因組瀏覽器 hg19）對齊，然后通過Samtools（v1.3.1）進行排序，并通過Picard（v1.141）去除重復(fù)標(biāo)記。在第二次后比對處理步驟中，進行局部讀取重新對齊以修正插入缺失（indel）周圍的潛在比對錯誤。由于插入缺失邊緣附近的讀取映射通常會導(dǎo)致錯配堿基，從而產(chǎn)生假陽性SNP調(diào)用，局部重新對齊利用這些錯配堿基確定是否應(yīng)重新對齊，并應(yīng)用計算密集型算法來確定讀取相對于插入缺失的最一致位置，去除比對偽影。更多詳細信息可從佳學(xué)基因醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司（中國北京，npz842.cn）。

變異檢測

每個讀取具有與測序錯誤概率相關(guān)的質(zhì)量評分。由于系統(tǒng)性偏差，報告的質(zhì)量評分已知不準(zhǔn)確，因此在基因分型之前必須重新校準(zhǔn)。重新校準(zhǔn)后，輸出BAM中的重新校準(zhǔn)質(zhì)量評分將更接近測序錯誤的概率[25]。

可以使用基因組分析工具包（GATK，https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices）生成變異調(diào)用，該工具包通過貝葉斯推斷檢查參考變異的證據(jù)。高斯混合模型適用于為每個假定變異調(diào)用分配準(zhǔn)確的置信評分，并評估新的潛在變異。

變異注釋

生物功能注釋是找到遺傳變異與疾病之間聯(lián)系的關(guān)鍵步驟。使用SnpEff添加生物信息到變異集合中。使用ANNOVAR軟件工具和內(nèi)部代碼對所有突變進行注釋，并參考臨床變異數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）。為了進一步篩選，使用1000基因組計劃（http://www.1000genomes.org/）、外顯子聚合聯(lián)盟（ExAC）瀏覽器、SIFT（http://sift.jcvi.org）和PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）預(yù)測變異功能。

桑格測序

桑格測序由SJ-Bio有限公司（中國廣州，www.saikabio.com）執(zhí)行。使用Premier 3.0設(shè)計引物；引物序列見附表1。桑格測序產(chǎn)品通過ABI 3730遺傳分析儀分離，數(shù)據(jù)使用Chromas V1.0.0.1進行分析。

非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測結(jié)果

臨床特征

受試者是一家來自南方的漢族家庭，具有家族性非綜合征性唇裂和腭裂（見圖1）。在該家庭中，II3、II4和III2是表現(xiàn)為非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的先證者。I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3和III4是沒有非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P表型的家族成員。在佳學(xué)基因檢測分析的這一病例中，合計有5名成員，其中三人有完全性唇裂和腭裂，兩人作為正常對照。所有患者均在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的唇腭裂治療中心進行診斷和治療。其中II3（見圖2A）和II4（見圖2B）為父母，術(shù)后為單側(cè)完全性唇裂和腭裂；III2（見圖2C）為兒子，術(shù)前為雙側(cè)完全性唇裂和腭裂。圖2D顯示了先證者術(shù)后1年的臨床特征。根據(jù)這些臨床特征，使用全基因組測序和全外顯子組測序檢測可能的遺傳損傷，以揭示疾病發(fā)生的基因原因，并幫助家族阻斷這種多代發(fā)生的現(xiàn)象。

基因組測序

對非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家庭的5名成員進行了全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）。WGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量因篇幅原因不在此處展示。Phred質(zhì)量評分（Q），即基于錯誤率P的對數(shù)，描述了每個測序堿基的可靠性。例如，如果一個堿基正確率為99%，則質(zhì)量值為20（Q20）；如果堿基正確率為99.9%，則質(zhì)量值為30（Q30）。在WGS結(jié)果中，總有效數(shù)據(jù)范圍為92.56億堿基對（Gb），深度（x）為31.98到108.5億堿基對（Gb），深度（x）為37.49。有效數(shù)據(jù)的平均比率為99.9%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分別為97.64%、93.70%和41.31%。WES原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量總結(jié)通過表格展示，此處省略?？傆行?shù)據(jù)的平均值為12.60億堿基對（Gb），深度（x）為217.24。有效數(shù)據(jù)的平均比率為98.2%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分別為98.35%、95.47%和53.44%。在2×最小深度測量下，目標(biāo)區(qū)域覆蓋率為97.61%。在10×、20×和30×測量下，目標(biāo)覆蓋率分別為96.04%、92.15%和85.00%。因此，深度和覆蓋率應(yīng)足以可靠地檢測大多數(shù)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的DNA變異。

遺傳發(fā)現(xiàn)

使用1000基因組計劃、外顯子聚合聯(lián)盟（ExAC）瀏覽器、SIFT和PolyPhen-2對結(jié)構(gòu)變異功能進行了注釋。結(jié)果篩選出總計7624個突變，包括WGS隊列中的1754個突變（23.0%）和WES隊列中的123個突變（1.6%）。WGS、WES和臨床變異數(shù)據(jù)庫的綜合分析顯示，在3個研究隊列中共有9個位點變異（RESP18、LSR、SPATS2L、ZNF277、IHH、C2orf69、KIR3DL1、MUC3A和PRKAG3）（見圖5）。在這些變異位點中，發(fā)現(xiàn)RESP18基因中的2個突變位點（rs2385404和rs2385405），這些突變位點與唇裂和腭裂相關(guān)，并且在非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者中同型突變伴有更嚴(yán)重的癥狀，這些突變是非同義單核苷酸變異（SNVs），導(dǎo)致功能變化。由于未發(fā)現(xiàn)類似的錯義變異，例如某些是同義變異或與RESP18調(diào)控內(nèi)分泌特異性蛋白18關(guān)系較小，排除了8個突變。為了驗證WES檢測到的DNA序列變異，使用了標(biāo)準(zhǔn)方法桑格測序。

桑格測序

通過桑格測序，在所有5名家庭成員中檢測到了RESP18基因（NM_001007089.4）的2個變異位點（rs2385404和rs2385405）。桑格測序驗證顯示，rs2385404和rs2385405的突變與WGS和WES結(jié)果一致。桑格測序結(jié)果表明，RESP18的突變（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）導(dǎo)致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。桑格測序結(jié)果還表明，RESP18變異（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）導(dǎo)致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu轉(zhuǎn)變?yōu)長ys。這兩個變異均為錯義變異。因此，這一結(jié)果確認了RESP18基因變異是該家系中的致病變異。

非綜合征唇腭裂遺傳病基因檢測結(jié)果的解釋與說明

Sanger測序確認了RESP18基因序列（GRCh38.p14 chr2）中的變異（rs2385404和rs與2385405）。

• (A) Sanger測序顯示，RESP18基因的突變（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）導(dǎo)致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）變成了Asp（天冬氨酸）。

• (B) Sanger測序結(jié)果顯示，RESP18變異（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）導(dǎo)致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）變成了Lys（賴氨酸）。

在這個結(jié)果中，Glu – 谷氨酸，Asp – 天冬氨酸，Lys – 賴氨酸。

解釋：

1. 變異的確認：

   • rs2385404 和 rs2385405 是在RESP18基因中的兩個已知變異位點，Sanger測序技術(shù)確認了這些變異的存在。

2. 具體的突變信息：

   • (A) rs2385404變異（c.90G>T）表示在RESP18基因的第90位堿基由G（鳥嘌呤）突變?yōu)門（胸腺嘧啶），導(dǎo)致RESP18蛋白的第30位氨基酸由Glu（谷氨酸）變?yōu)锳sp（天冬氨酸）。這種氨基酸的改變可能影響蛋白質(zhì)的功能。
   • (B) rs2385405變異（c.157G>A）表示在RESP18基因的第157位堿基由G（鳥嘌呤）突變?yōu)锳（腺嘌呤），導(dǎo)致RESP18蛋白的第53位氨基酸由Glu（谷氨酸）變?yōu)長ys（賴氨酸）。這同樣可能對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響。

3. 氨基酸變化的意義：

   • Glu（谷氨酸） 和 Asp（天冬氨酸） 都是酸性氨基酸，但它們的化學(xué)性質(zhì)略有不同，這種變化可能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。
   • Lys（賴氨酸） 是堿性氨基酸，替換掉Glu（谷氨酸）可能會顯著改變蛋白質(zhì)的電荷和功能。

總體來說，這些變異可能會對RESP18蛋白的功能產(chǎn)生影響，進而對與該基因相關(guān)的生理過程或疾病風(fēng)險產(chǎn)生潛在影響?；驒z測結(jié)果有助于理解這些變異的具體作用及其可能的臨床意義。

佳學(xué)基因檢測唇腭裂基因檢測的優(yōu)勢

非綜合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是中國最常見的先天性畸形之一，其中近20%為家族性病例。NSCLP與多種因素相關(guān)，其發(fā)病機制并非為很多臨床醫(yī)生所知曉。本病例分析認為，易感基因與胚胎發(fā)育過程中腭部形態(tài)發(fā)生異常和組織融合的NSCLP密切相關(guān)。通過連鎖分析、基因組重排、候選基因以及全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）等多種方法，研究人員發(fā)現(xiàn)了與NSCLP相關(guān)的關(guān)鍵基因。例如，SATB2和IRF6基因上發(fā)現(xiàn)的幾個變異與NSCLP的原因密切相關(guān)?；蚪獯a通過GWAS研究識別了41個具有全基因組顯著性的SNPs，這些SNPs位于14個基因（RAD54B、TMEM19、KRT18、WNT9B、GSC/DICER1、PTCH1、RPS26、OFCC1/TFAP2A、TAF1B、FGF10、MSX1、LINC00640、FGFR1和SPRY1）的26個基因座上。致病基因鑒定分析過程中進行了非洲的全基因組測序（WGS）分析，識別了162個高置信度的致病性新生突變（DNMs）?；蚪獯a對來自獨立家庭的個體進行全外顯子組測序（WES），建議5個候選基因（ACACB、PTPRS、MIB1、GRHL3、CREBBP）的稀有變異可能與NSCLP風(fēng)險相關(guān)。通過聚合酶鏈反應(yīng)和Sanger測序?qū)WAS中與歐洲人群NSCLP密切相關(guān)的Vax1基因的rs7078160進行基因分型，并通過病例對照和家系關(guān)聯(lián)研究比較了突變。因此，NSCLP可能與候選基因的突變有關(guān)。

在本病案中，佳學(xué)基因檢測使用了全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）來識別在東南部漢族NSCLP家族中的易感變異。在這個家族中，父母（II3和II4）有單側(cè)完全唇裂和腭裂，而III2有雙側(cè)完全唇裂和腭裂?；蚪M分析顯示該NSCLP家族中RESP18基因存在2個突變。巧合的是，患者II3和II4具有雜合突變，而III2具有純合突變。唇腭裂致病基因鑒定基因解碼的結(jié)果表明，NSCLP的表型差異和嚴(yán)重程度與RESP18基因突變相關(guān)。進一步的Sanger測序結(jié)果也得出了相同的結(jié)論。因此，唇腭裂致病基因分析認為RESP18是NSCLP發(fā)展的一個重要基因，并且與腭裂的嚴(yán)重程度相關(guān)。

調(diào)節(jié)性內(nèi)分泌特異性蛋白18（RESP18）是一種18千道爾頓的蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中。作為促腎上腺皮質(zhì)激素分泌途徑中的重要糖皮質(zhì)激素反應(yīng)蛋白，RESP18受多巴胺、糖皮質(zhì)激素和胰島素等生理和藥理刺激的調(diào)節(jié)。此外，RESP18參與調(diào)節(jié)邊緣系統(tǒng)和自主功能，調(diào)控細胞骨架和神經(jīng)突生長，從而通過轉(zhuǎn)錄后O-糖基化影響器官發(fā)育。因此，RESP18可能是面部頜部發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，其異常表達對唇裂和腭裂的發(fā)生有重大影響。

總之，NSCLP的發(fā)生率和病情與RESP18基因突變相關(guān)?；蚪獯a認為推測RESP18基因在唇裂和腭裂的發(fā)病機制中扮演著重要角色，并且該基因可能與NSCLP家族的病因預(yù)測有關(guān)。

創(chuàng)新性說明：

1. 應(yīng)用全基因組測序（WGS）和全外顯子組測序（WES）：

   • 本案例采用WGS和WES技術(shù)來識別NSCLP的易感變異，這是相對于傳統(tǒng)方法（如GWAS和單一基因分析）的一種創(chuàng)新。這種方法提供了更全面的基因組信息，有助于發(fā)現(xiàn)那些可能被遺漏的變異。

2. 發(fā)現(xiàn)RESP18基因的相關(guān)性：

   • 研究發(fā)現(xiàn)RESP18基因的突變與NSCLP的嚴(yán)重程度相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)明確了RESP18在NSCLP中的作用。這一發(fā)現(xiàn)有助于進一步理解NSCLP的遺傳機制，并提供了新的研究方向。

3. 對表型和基因型的關(guān)聯(lián)分析：

   • 通過將表型（如唇裂和腭裂的類型和嚴(yán)重程度）與基因型（如RESP18的突變類型）進行詳細關(guān)聯(lián)分析，研究揭示了基因變異如何影響臨床表現(xiàn)。這種方法的創(chuàng)新性在于將遺傳變異與具體的臨床特征直接關(guān)聯(lián)，為個體化治療提供了依據(jù)。

4. 潛在的臨床應(yīng)用：

   • 研究結(jié)果提示RESP18可能作為NSCLP的生物標(biāo)志物，用于早期預(yù)測和風(fēng)險評估，這對臨床診斷和預(yù)防具有重要意義。