【佳學(xué)基因檢測】地中海貧血基因檢測

地中海貧血基因檢測導(dǎo)讀：

地貧在中國東南部地區(qū)發(fā)病率較高。這項為期 10 年的隨訪研究旨在確定中國東南部福建省地貧攜帶者胎兒樣本中地貧的基因型和核型。共收集了 472 對攜帶 α 地貧特征的夫婦的 476 個產(chǎn)前樣本和 223 對攜帶 β 地貧特征的夫婦的 224 個樣本，進行 STR 分析、地貧基因型檢測和核型分析。使用 Gap-PCR 檢測法檢測常見的缺失型 α 地貧和罕見地貧基因型，使用 PCR-RDB 檢測法檢測常見的β珠蛋白基因突變。 476 例 α 地貧夫婦產(chǎn)前樣本中，輕型 α 地貧患病率為 43.49%，中型和重型 α 地貧患病率為 26.05%，罕見型 α 地貧患病率為 1.89%；224 例 β 地貧夫婦產(chǎn)前樣本中，85 例胎兒為 β 地貧雜合子，16 例為純合子，21 例為雙重雜合子，1 例為罕見的 β IVS−2−654(C→T) /Chinese G γ ( A γδβ) 0 基因型。核型分析顯示 7 例胎兒核型異常。共終止妊娠 153 例，引產(chǎn)后利用胎兒臍帶血進行地貧基因診斷與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。正常嬰兒出生半年后未發(fā)現(xiàn)任何地中海貧血表型，α地中海貧血和輕型β地中海貧血嬰兒無貧血癥狀或有輕微貧血癥狀，發(fā)育正常，而15名患有血紅蛋白H病的嬰兒出現(xiàn)中度貧血癥狀。地中海貧血基因檢測的數(shù)據(jù)建議對攜帶地中海貧血特征的夫婦進行孕前地中海貧血篩查，特別是復(fù)合型和罕見型地中海貧血。

地中海貧血基因檢測關(guān)鍵詞

隨訪研究、產(chǎn)前診斷、中國東南部、地中海貧血、α-地中海貧血、β-地中海貧血

為什么要開展地中海貧血基因檢測？

地中海貧血是一組因一種或多種特定珠蛋白鏈（通常是 α 或 β）合成不足或無法生成而引起的遺傳性血液疾病。地中海貧血是世界上最常見的單基因遺傳性疾病，在地中海地區(qū)、中東、印度次大陸、東南亞和中國南部地區(qū)十分常見。全球約有 3.5 億人是地中海貧血基因攜帶者，全球攜帶者的比例正在增加。地中海貧血有兩種主要臨床類型，包括 α 地中海貧血和 β 地中海貧血，這種遺傳性疾病主要表現(xiàn)為慢性溶血性貧血、腸道鐵吸收增加、α/β 珠蛋白鏈比例失衡、紅細胞生成無效、代償性造血擴增和高凝狀態(tài)。

目前，地中海貧血的治療主要取決于臨床嚴重程度（重型地中海貧血、中型地中海貧血和輕型地中海貧血），傳統(tǒng)治療包括輸血和鐵螯合療法，特殊情況下還可進行脾切除術(shù)；但迄今為止，尚無針對重型地中海貧血的有效治療方法。對于攜帶地中海貧血基因的夫婦，在妊娠第一和第二個三個月進行產(chǎn)前診斷被認為是預(yù)防重型地中海貧血胎兒出生的最有效方法。在這項為期 10 年的單中心研究中，地中海貧血基因檢測對地中海貧血攜帶者胎兒樣本中地中海貧血的基因型和核型進行了鑒定，并跟蹤了地中海貧血高度流行的中國東南部福建省的妊娠結(jié)果。

地中海貧血基因檢測

2009 年 1 月至 2018 年 12 月期間，福建省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心共納入了 695 對確診為地貧的夫婦（其中 5 對為雙胎妊娠）。其中 472 對攜帶 α 地貧特征的夫婦（其中 4 對為雙胎妊娠）采集了 476 份產(chǎn)前樣本，223 對攜帶 β 地貧特征的夫婦（其中 1 對為雙胎妊娠）采集了 224 份產(chǎn)前樣本，并進行了后續(xù)分析。

產(chǎn)前樣本和胎兒DNA提取

孕周11～14周在B超引導(dǎo)下經(jīng)腹腔穿刺采集絨毛37例，孕周16～24周在B超引導(dǎo)下經(jīng)羊膜穿刺采集羊水537例（每例20 mL），孕周24～36周在B超引導(dǎo)下經(jīng)臍帶穿刺采集臍血126例，采用Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit（德國希爾登Qiagen公司）提取基因組DNA，用于后續(xù)實驗。

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分析基因檢測

從夫婦身上采集 EDTA 抗凝外周血樣本，并使用血液和細胞培養(yǎng) DNA Maxi 試劑盒（Qiagen；德國希爾登）分離基因組 DNA。使用人類三體（T21、T13、T18 和性）多倍體分析試劑盒（中山大學(xué)達安基因有限公司，廣州，中國）進行多重 PCR 檢測，以擴增Amelogenin基因和 14 個 STR 焦點，包括 13 號染色體上的 4 個焦點（D13S628、D13S742、D13S634 和 D13S305），18 號染色體上的 4 個焦點（D18S1002、D18S391、D18S535 和 D18S386），21 號染色體上的 3 個焦點（D21S1435、D21S1411 和 D21S11）和性染色體上的 3 個焦點（DXS981、DXS6809 和 X22）。然后，用 ABI 3130xl DNA 測序儀（Applied Biosystems；美國加利福尼亞州福斯特城）上的毛細管電泳檢查擴增產(chǎn)物，并鑒定是否存在母體細胞污染。

常見缺失型α地中海貧血的檢測

使用地中海貧血基因檢測試劑盒按照制造商的說明，采用 Gap-PCR 檢測三種常見的缺失型 α 地中海貧血，包括- -SEA、 -α 3.7和 -α 4.2 突變、α珠蛋白基因中的8和 3 點突變，使用聚合酶鏈反應(yīng)-反向斑點雜交 (PCR-RDB) 檢測法，使用地中海貧血基因檢測試劑盒按照制造商的指南進行鑒定，包括 αQS 、 α CS、 α QS和 α WS缺失。

常見β珠蛋白基因突變檢測

使用地中海貧血基因檢測試劑盒按照制造商的說明，采用 PCR-RDB 檢測方法檢測了17 種常見的β珠蛋白基因突變。

罕見地中海貧血基因型的檢測

采用Gap-PCR檢測缺失型α地中海貧血的‐‐THAI /αα和‐27.6 /αα基因型，并采用地中海貧血基因檢測試劑盒按照制造商的說明，采用Gap-PCR檢測缺失型β地中海貧血基因（東南亞、中國和臺灣缺失突變）。

核型分析基因檢測

常規(guī)取絨毛、羊水、臍帶血樣本進行培養(yǎng)、封片、G顯帶分析，采用GSL-120 Streamlines細胞遺傳學(xué)分析系統(tǒng)（德國曼海姆徠卡公司）進行核型分析，每例至少計數(shù)20個核型，隨機選取5個核型進行分析。

妊娠結(jié)局隨訪

對 695 對夫婦進行產(chǎn)前診斷一年后電話隨訪，了解重癥地中海貧血胎兒的結(jié)局。此外，對非重癥地中海貧血胎兒在出生一年后進行表型和發(fā)育情況的隨訪，以驗證產(chǎn)前診斷的準確性。地中海貧血基因檢測將血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征和血紅蛋白 H 病定義為重癥 α 地中海貧血，將突變純合子和雙重雜合子定義為重癥 β 地中海貧血。

地中海貧血基因檢測結(jié)果

產(chǎn)前樣本的 STR 分析和地中海貧血的嚴重程度

700 份產(chǎn)前樣本中，476 份來自 α 地中海貧血胎兒樣本，包括 29 份絨毛樣本、368 份羊水樣本和 79 份臍帶血樣本；224 份來自 β 地中海貧血胎兒樣本，包括 8 份絨毛樣本、169 份羊水樣本和 47 份臍帶血樣本。羊水是地中海貧血基因檢測中產(chǎn)前樣本的主要類型（圖 1)。對這些產(chǎn)前樣本進行STR分析表明，沒有受到母體細胞污染。

圖1：2009 年至 2018 年中國東南部福建省地中海貧血攜帶者的產(chǎn)前絨毛、羊水和臍帶血樣本比例

在來自 695 對地中海貧血夫婦的 700 個產(chǎn)前樣本中，在來自 α 地中海貧血夫婦的 476 個產(chǎn)前樣本中檢測到 136 個正常胎兒、210 個輕型地中海貧血胎兒和 130 個中型和重型地中海貧血胎兒；在來自 β 地中海貧血夫婦的 224 個產(chǎn)前樣本中檢測到 101 個正常胎兒、85 個輕型地中海貧血胎兒和 38 個中型和重型地中海貧血胎兒（圖 2）。

圖 2：2009 年至 2018 年中國東南部福建省地中海貧血攜帶者的產(chǎn)前絨毛、羊水和臍帶血樣本中檢測到的 α 地中海貧血和 β 地中海貧血表型。A，α 地中海貧血；B，β 地中海貧血

胎兒地中海貧血的基因型

476 份來自 α 地中海貧血夫婦的產(chǎn)前樣本中，胎兒中檢出 3 種常見的缺失突變、3 種非缺失突變以及罕見的-THAI和 -α 27.6 突變，其中 136 份樣本（28.57%）胎兒正常，210 份樣本（43.49%）為 α 地中海貧血次要基因型，130 份樣本（27.31%）為 α 地中海貧血中間和主要基因型，包括 6 份樣本為罕見形式，9 份樣本（1.89%）為罕見形式的 α 地中海貧血（表 1）。

表1：476 份產(chǎn)前樣本中檢測到的 α 地中海貧血基因型

在來自β地中海貧血夫婦的224份產(chǎn)前樣本中，胎兒中檢測到8種常見的β地中海貧血基因型，包括101例正常胎兒，16例純合子，21例雙重雜合子，并發(fā)現(xiàn)了一種罕見的βIVS -2-654（C→T） /中國Gγ （ Aγδβ ） 0基因型 （表 2）。

表 2：224 份產(chǎn)前樣本中檢測到的 β 地中海貧血基因型

3.3. 染色體核型

700 例產(chǎn)前樣本的核型分析顯示 693 種核型正常，7 種核型異常，包括 1 例絨毛 G 顯帶顯示‐‐SEA /‐‐SEA α 地中海貧血基因型和 (47, XX, +16) 核型，1 例臍血核型分析顯示 β CD27−28 ( + C) /β N β地中海貧血基因型和 21 號易位三體 [(46, XX, rob (14;21) (q10:q10)]，4 例羊水樣本 G 顯帶顯示 αα/ααα 地中海貧血基因型和 (46, XN, inv(9) (p12;q13) 核型，以及 1 例羊水樣本 G 顯帶分析顯示，αα/ααα‐地中海貧血基因型為 (46, XN, 21P-) 核型（表 3）。

表3：700 例產(chǎn)前樣本的核型分析及 7 種異常核型的詳細信息

后續(xù)結(jié)果

695 名地中海貧血孕婦均未發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥，700 例妊娠中 153 例因地中海貧血而終止妊娠，其中包括 86 例胎兒攜帶‐‐SEA突變，5 例攜帶 ‐‐THAI / ‐‐ SEA基因型，24 例患有血紅蛋白 H ?。ò?10 例攜帶‐‐SEA /‐α 3.7，5 例攜帶‐‐SEA /‐α 4.2，6 例攜帶−−SEA /α QS α ，2 例攜帶−−SEA /α CS α ，1 例攜帶‐‐SEA /‐α 27.6 基因型），16 例患有 β 地中海貧血突變純合子，21 例患有 β 地中海貧血雙雜合子，以及 1 例胎兒攜帶 β IVS−2−654(C→T) /Chinese G γ ( A γδβ）0 基因型。引產(chǎn)后采集胎兒臍帶血進行地中海貧血的基因診斷，結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。

7例核型異常胎兒中，1例為(47，XX，+16)核型合并‐‐SEA突變及1例為21三體易位[(46，XX，rob(14;21) (q10:q10)]且基因型為β CD27−28(+C) /β N]終止妊娠，另5例核型異常胎兒繼續(xù)妊娠。

所有正常胎兒、α地中海貧血和輕型β地中海貧血胎兒及15例血紅蛋白H病胎兒均繼續(xù)妊娠，產(chǎn)前診斷一年后電話隨訪發(fā)現(xiàn)，正常新生兒出生半年后未出現(xiàn)地中海貧血表型，α地中海貧血和輕型β地中海貧血新生兒無貧血癥狀或有輕微貧血癥狀，發(fā)育正常，15例血紅蛋白H病新生兒出現(xiàn)中度貧血癥狀。
 

地中海貧血基因檢測的作用和意義

福建省位于我國東南沿海，是地中海貧血的高發(fā)省份。2013年分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，福建省地中海貧血總體患病率為4.14%，其中α地中海貧血和β地中海貧血的患病率分別為3.17%和1.32%。近期一項納入189,414名受試者的研究結(jié)果顯示，福建省地中海貧血總體患病率為6.8%，其中α地中海貧血和β地中海貧血的患病率分別為4.84%和1.87%，進一步證實了福建省是地中海貧血的高發(fā)省份。當前，加大地中海貧血的產(chǎn)前篩查和診斷力度，減少漏診和誤診是我國地中海貧血防控的首要目標。

通過產(chǎn)前診斷防止重型地貧新生兒出生被廣泛認為是預(yù)防地中海貧血的最有效方法。18自2013年 12 月全國免費地貧防治項目啟動以來，福建省地貧高發(fā)地區(qū)開展了婚前、孕前及產(chǎn)前地貧篩查，同時加強地貧知識健康教育，旨在降低新生兒地貧患病率。在2009 年至 2018 年的 10 年研究期間，后 5 年接受產(chǎn)前診斷的胎兒數(shù)量（487 例）大約是前 5 年接受產(chǎn)前診斷的胎兒數(shù)量（213 例）的 2.3 倍。這是因為自 2013 年 12 月全國免費地貧防治項目啟動以來，福建省地貧的覆蓋范圍大大擴大。總體而言，地中海貧血基因檢測檢測到 130 例胎兒患有嚴重形式的 α 地中海貧血（血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征或血紅蛋白 H ?。?，38 例胎兒患有嚴重形式的 β 地中海貧血（突變純合子或雙重雜合子）。地中海貧血基因檢測的研究結(jié)果表明，對高危人群進行廣泛的產(chǎn)前篩查可能會增加地中海貧血的發(fā)現(xiàn)率，這對降低出生缺陷的發(fā)生率是有效的。作為迄今為止規(guī)模最大的研究，這項為期 10 年的隨訪研究報告了對福建省地中海貧血夫婦的產(chǎn)前樣本的分子分析，為地中海貧血的預(yù)防和控制提供了寶貴的數(shù)據(jù)。

目前臨床用于產(chǎn)前診斷的樣本主要有絨毛、羊水和臍帶血。B超引導(dǎo)下腹腔穿刺可實現(xiàn)早期診斷，減輕孕婦心理負擔，但該技術(shù)存在技術(shù)要求高、胎兒丟失率高的問題，難以推廣應(yīng)用。羊水是產(chǎn)前診斷的主要樣本類型（約77%），對胎兒相對安全，地中海貧血的產(chǎn)前診斷大多通過超聲引導(dǎo)下羊膜穿刺術(shù)實現(xiàn)。臍帶血用于晚期產(chǎn)前診斷，對于超過羊水培養(yǎng)最佳時間，需要進行地中海貧血基因篩查和染色體診斷的個體是可行的，但該技術(shù)存在技術(shù)要求高、胎兒丟失率高、術(shù)中胎兒并發(fā)癥多的問題。地中海貧血基因檢測中羊水樣本數(shù)量在研究期間呈上升趨勢，而臍帶血樣本數(shù)量呈下降趨勢。這歸因于隨著對地中海貧血知識認識的提高，地中海貧血的產(chǎn)前診斷大多在妊娠早期進行。

產(chǎn)前樣本來源于母體，母體細胞污染可能極大地影響產(chǎn)前診斷的準確性。因此，產(chǎn)前樣本包括絨毛、羊水和臍帶血，在排除母體細胞污染后可用于產(chǎn)前診斷。地中海貧血基因檢測對 700 份產(chǎn)前樣本進行 STR 分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)母體細胞污染，這些產(chǎn)前樣本符合后續(xù)分析的條件。

地中海貧血基因檢測在 476 例 α 地中海貧血夫婦的產(chǎn)前樣本中，檢測到了 91 例血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征胎兒。血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征是由于 4 個 α 珠蛋白基因缺失導(dǎo)致α 珠蛋白合成完全喪失所致，妊娠晚期發(fā)病可能導(dǎo)致宮內(nèi)或產(chǎn)后胎兒死亡，以及浮腫、高血壓、蛋白尿和產(chǎn)后出血等產(chǎn)婦并發(fā)癥。另外5 例攜帶 ‐‐ THAI / ‐‐ SEA α 地中海貧血缺失的胎兒在超聲檢查中發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征。迄今為止，‐‐ THAI α 地中海貧血基因型僅在中國南方地區(qū)（如廣東、廣西、臺灣和福建）有報道。由于α珠蛋白基因Thai 缺失不屬于常規(guī)地中海貧血篩查范圍，若無法獲得血紅蛋白 Bart 胎兒積水綜合征的臨床表現(xiàn)和基因檢測結(jié)果，漏診風險很高。地中海貧血基因檢測診斷 5 例胎兒為 ‐‐ THAI / ‐‐ SEA缺失，其父母攜帶東南缺失，另 1 例胎兒未檢測到常見缺失，最終確診依靠血液學(xué)表型和胎兒超聲檢查。因此，對于原因不明、血液學(xué)參數(shù)異常的胎兒積水，應(yīng)考慮 Thai 缺失型 α 地中海貧血引起的非免疫性 Bart 胎兒積水綜合征，尤其是在中國南方，那里是地中海貧血的高發(fā)地區(qū)。目前，商品化的 α 地中海貧血檢測試劑盒只能檢測中國人群常見的 3 種缺失和 3 種突變類型，無法檢測泰國的缺失型 α 地中海貧血。30因此，強烈建議將基因分型納入地中海貧血的產(chǎn)前診斷中，因為精準的產(chǎn)前診斷對于預(yù)防地中海貧血的發(fā)展和遺傳咨詢至關(guān)重要。

目前醫(yī)院對地貧的篩查以孕婦常規(guī)血液檢測和血紅蛋白分析為主，若孕婦篩查結(jié)果異常則其丈夫也要進行地貧檢測，容易導(dǎo)致漏診。地中海貧血基因檢測 39例血紅蛋白H病胎兒中， 30例為--SEA / -α3.7和--SEA / -α4.2基因型，8例為--SEA /αQSα和--SEA / αCSα基因型，1例為--SEA / -α27.6 基因型。提示α地貧仍然是福建省出生缺陷控制的重點，如果母親攜帶α地貧-1型，且有典型的平均紅細胞體積減少，則無漏診風險；但如果母親是α‐地中海貧血-2攜帶者，父親是α‐地中海貧血-1攜帶者，則很可能出現(xiàn)漏診，因為α‐地中海貧血-2攜帶者（輕型地中海貧血、無癥狀地中海貧血，尤其是血紅蛋白恒定泉?。┛赡芷骄t細胞體積正常，血紅蛋白分析沒有特異性改變。因此，如果夫婦中一人確診為地中海貧血基因攜帶者，另一人必須接受地中海貧血基因檢測。在地中海貧血基因檢測中，α‐地中海貧血‐α 27.6 基因型的病例在常規(guī)血液檢測中沒有異常；然而，在其家系成員中發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白A2（HbA2）水平顯著降低和中度貧血，提示為血紅蛋白H病，進一步的分子診斷顯示為‐‐SEA /‐α 27.6基因型，這表明遺傳咨詢的重要性。這些數(shù)據(jù)表明，一些罕見的缺失類型未被常規(guī)檢測試劑盒覆蓋，由此造成的漏診可能導(dǎo)致患有血紅蛋白H病的胎兒出生。

地中海貧血基因檢測納入224例β地貧夫婦產(chǎn)前樣本，共檢測出8種常見β地貧基因型，其中101例胎兒β基因型正常，85例胎兒為雜合子，16例胎兒為純合子，21例胎兒為雙重雜合子，1例胎兒為βIVS −2−654（C→T） /中國Gγ（Aγδβ）0 基因型。對于夫妻雙方均為β地貧攜帶者，其子女大多表現(xiàn)為經(jīng)典的小細胞低色素性貧血和HbA2升高，漏診可能性較低。由于β-地貧的表型可能覆蓋α-地貧的表型，因此，α-地貧和β-地貧夫婦的胎兒需要同時進行α-地貧和β-地貧的基因診斷，以避免漏診。地中海貧血基因檢測中1例病例診斷為βIVS −2−654(C→T) /中國Gγ ( Aγδβ ) 0 基因型。β-珠蛋白基因缺失少見，但β-珠蛋白基因缺失攜帶者與β-地貧攜帶者結(jié)婚后，胎兒有患中型和重型β-地貧的風險。由于目前使用的β地貧基因檢測試劑盒無法檢測出β珠蛋白基因缺失，從而導(dǎo)致中型和重型β地貧的漏診，因此，在對血紅蛋白F水平明顯增高的個體進行常見地貧基因產(chǎn)前診斷時，需要附加檢測罕見缺失型β地貧基因，以避免中型和重型β地貧胎兒的出生。

地中海貧血基因檢測對700例產(chǎn)前樣本進行核型分析，發(fā)現(xiàn)2例胎兒羊水細胞培養(yǎng)存在核型異常，因此終止妊娠。因此，對有其他產(chǎn)前診斷陽性指征的孕婦，需重視其他遺傳病的產(chǎn)前診斷指征，避免漏診除地中海貧血以外的遺傳病。

地中海貧血基因檢測的意義和作用

總之，這項為期 10 年的大規(guī)模隨訪研究展示了中國東南部福建省地中海貧血夫婦產(chǎn)前樣本的分子分析結(jié)果。因此，地中海貧血基因檢測強烈建議對攜帶地中海貧血特征的夫婦進行地中海貧血（尤其是復(fù)合型和罕見型地中海貧血）的妊娠前篩查，此時應(yīng)包括染色體異常的額外基因診斷。高危人群的產(chǎn)前診斷可以防止地中海貧血主要攜帶者的出生和不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，保護患者的健康并提高人口素質(zhì)。