【佳學(xué)基因檢測(cè)】一文讀懂基因檢測(cè)技術(shù)及其發(fā)展方向

在大多數(shù)情況下，臨床分子診斷技術(shù)仍然側(cè)重于確定患者的潛在致病機(jī)制。佳學(xué)基因總結(jié)了適用于遺傳性的基因型和核型的基因檢測(cè)方法。通過(guò)直接基因檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室尋找導(dǎo)致某種疾病的特定遺傳變異，而間接性基因檢測(cè)則是比較與感興趣的性狀相關(guān)但不會(huì)導(dǎo)致遺傳疾病的DNA序列。

CGH:比較基因組雜交；FISH:熒光原位雜交；MLPA，多重連接依賴探針擴(kuò)增；SNP:單核苷酸多態(tài)性；STR:短串聯(lián)重復(fù)序列；WES:全外顯子組測(cè)序；WGS，全基因組測(cè)序。

*可以檢測(cè)家族突變或基因組重排。

‡這些列中的分類分配是主觀的，根據(jù)所訂購(gòu)測(cè)試的上下文和進(jìn)行測(cè)試的實(shí)驗(yàn)室而有所不同。提出“低”、“平均”和“高”是為了簡(jiǎn)化和比較平臺(tái)。

§低，<80%；平均為80-98%；高，大于98%。

||低，<80%；平均為80-98%；高，大于98%。

低，＜1周；平均1周1個(gè)月；高，超過(guò)1個(gè)月。

#不同實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試成本差異很大；然而，這些估計(jì)是基于實(shí)驗(yàn)室抽樣的測(cè)試費(fèi)用，而不是消耗品成本或報(bào)銷金額。低，低于400美元；平均400美元至2000美元；很高，超過(guò)2000美元。

**如果雙親都進(jìn)行了基因分型，則可以通過(guò)任何方法檢測(cè)單親二體。然而，在沒(méi)有親本遺傳樣本的情況下，只有指定的方法才能檢測(cè)單親二體。

拷貝數(shù)變異檢測(cè)在下一代測(cè)序應(yīng)用中正在改進(jìn)，但在WGS中比WES更有效，盡管它們?cè)谂R床診斷中的高效性有限。

技術(shù)的每一次轉(zhuǎn)變都需要評(píng)估新診斷平臺(tái)的質(zhì)量和可行性。（表3定義了可用于評(píng)估診斷試驗(yàn)的術(shù)語(yǔ)。）分析有效性是衡量分子試驗(yàn)檢測(cè)遺傳或基因組變異的能力的指標(biāo)，包括分析靈敏度（假陰性率）和分析特異性（假陽(yáng)性率）。相比之下，臨床有效性指的是測(cè)試預(yù)測(cè)是否存在臨床狀況的能力。

間接基因檢測(cè)

盡管在資金充足的實(shí)驗(yàn)室中有大量新技術(shù)用于查找患者的致病變異，但間接方法在世界上資源更為有限的地區(qū)（因此占人口的相當(dāng)一部分）的診斷中仍然發(fā)揮著重要作用；特別是，可以使用單核苷酸多態(tài)性（SNP）和短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的連鎖分析。經(jīng)典的間接方法（例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和異源雙鏈分析）在美國(guó)已基本被淘汰，但這些技術(shù)仍然在資源有限的發(fā)展中地區(qū)得到高度應(yīng)用。在某些情況下，間接測(cè)試可以通過(guò)縮小感興趣區(qū)域來(lái)提供全基因組數(shù)據(jù)；這是一種在研究中常用的方法，以節(jié)省WGS的成本。此外，對(duì)于一些特殊應(yīng)用，如產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）和植入前基因診斷（PGD），從微量樣本甚至單個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增和區(qū)分STR的能力使微衛(wèi)星連鎖分析成為一種有吸引力的方法。

靶向等位基因特異性突變檢測(cè)

擴(kuò)增結(jié)合限制性消化、雜交或其他檢測(cè)突變的方法仍然是臨床分子診斷中賊便宜和賊高效的方法。PCR突變檢測(cè)的簡(jiǎn)單性使檢測(cè)容量可以達(dá)到多個(gè)樣本，并為檢測(cè)變異提供了高置信度。例如，常見(jiàn)的致病性重復(fù)擴(kuò)增，如脆性X綜合征中的重復(fù)擴(kuò)增，經(jīng)常通過(guò)重復(fù)片段的直接擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。這種方法非常適合于對(duì)常見(jiàn)變異進(jìn)行簡(jiǎn)單的檢測(cè)，例如用于對(duì)藥物遺傳學(xué)變異或因子V萊頓突變進(jìn)行基因分型的Taqman®檢測(cè)。等位基因特異性PCR的缺點(diǎn)當(dāng)然是無(wú)法檢測(cè)到任何未曾報(bào)道過(guò)的相關(guān)基因突變。盡管如此，這些方法仍然具有很高的價(jià)值，特別是在資源有限和/或無(wú)法獲得先進(jìn)儀器的實(shí)驗(yàn)室中，并且很可能仍然是臨床分析的核心。

基因特異性Sanger測(cè)序

對(duì)于點(diǎn)突變和小變異的檢測(cè)，雙向桑格測(cè)序在過(guò)去十年被視為臨床基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。這種直接方法具有很高的分析有效性，盡管長(zhǎng)時(shí)間讀取可能會(huì)降低堿基調(diào)用的質(zhì)量，微小的樣本可能會(huì)產(chǎn)生人為的PCR產(chǎn)品。直接測(cè)序一個(gè)或多個(gè)完整基因的基本價(jià)值是將候選基因的臨床指征與分析的高靈敏度和特異性相結(jié)合的能力。例如，單個(gè)基因（即FGFR2）的集中測(cè)序可以以相當(dāng)?shù)偷某杀敬_認(rèn)或排除阿佩特綜合征的診斷，測(cè)序TCOF1將檢測(cè)到Treacher-Collins綜合征患者中高達(dá)90%的突變，而對(duì)已知導(dǎo)致努南綜合征的六個(gè)基因（即PTPN11、SOS1、RAF1、NRAS、CBL和KRAS）的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30%的個(gè)體出現(xiàn)了突變，其臨床特征提示努南綜合癥。隨著全基因組技術(shù)分析有效性的提高，基因組測(cè)序可能會(huì)成為遺傳分析的第一步，為候選基因桑格測(cè)序提供信息。值得注意的是，盡管桑格測(cè)序具有較高的分析有效性，但該方法的臨床有效性取決于疾病的致病基因。桑格測(cè)序不能檢測(cè)到大多數(shù)結(jié)構(gòu)變化，因此單靠它不足對(duì)許多疾病進(jìn)行診斷。

全基因組SNP微陣列基因檢測(cè)

基于微陣列的基因分型可分為三種主要應(yīng)用：用于檢測(cè)結(jié)構(gòu)異常的陣列比較基因組雜交（陣列CGH）（見(jiàn)下文討論）、表型特異性SNP面板和全基因組SNP面板。學(xué)術(shù)和商業(yè)實(shí)驗(yàn)室的努力已經(jīng)產(chǎn)生了表型特異性面板，其中包含已知驅(qū)動(dòng)特定表型的等位基因，例如視網(wǎng)膜退化面板34，35。這種方法的實(shí)用性在于，一個(gè)低成本、快速的多基因詢問(wèn)實(shí)驗(yàn)可以提供高質(zhì)量的分子診斷。然而，不斷發(fā)現(xiàn)新的因果等位基因和基因，以及已知突變的可變外顯率和表達(dá)36限制了該方法的臨床有效性（表3）。

相比之下，大規(guī)模全基因組SNP基因分型提供了一個(gè)單一、經(jīng)濟(jì)高效的平臺(tái)，可在一次測(cè)試中評(píng)估多種常見(jiàn)遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)，其中記錄的相關(guān)性各不相同36–38。預(yù)測(cè)性和癥狀前測(cè)試可作為多種疾病的多重平臺(tái)，包括某些癌癥和藥物遺傳學(xué)測(cè)試，以及眼科、心臟和心血管疾病，腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ǔ渌猓?。一些個(gè)人基因組公司現(xiàn)在向消費(fèi)者提供商業(yè)化臨床基因分型服務(wù)的版本，例如23andMe、Pathway Genomics和Navigenics的個(gè)人基因組服務(wù)，僅舉一個(gè)例子。雖然這些測(cè)試是為消費(fèi)者設(shè)計(jì)的，也可供消費(fèi)者使用，因?yàn)榉治鰷y(cè)試是在臨床（即CLIA認(rèn)證的）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的，這種全基因組SNP測(cè)試也可以由臨床醫(yī)生進(jìn)行。通過(guò)全基因組單核苷酸多態(tài)性測(cè)試，特定位點(diǎn)的分析有效性較高（表3），但變異檢測(cè)的有限范圍限制了對(duì)基因組中預(yù)選點(diǎn)的分析。此外，大多數(shù)基于SNP的診斷是概率性的，而不是確定性的，具有可變的臨床有效性40，因?yàn)殛嚵凶R(shí)別的變異范圍有限。例如，年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD；即CFH和HTRA1）的兩個(gè)主要基因座上的常見(jiàn)等位基因純合子在41-45之間具有很高的疾病概率值，并且由于一些SNP和吸煙46的純合子的高相關(guān)性，可能導(dǎo)致患者管理中的行為改變，但該測(cè)試本身預(yù)測(cè)AMD的能力有限。較新的混合平臺(tái)，如包含患者和對(duì)照個(gè)體中報(bào)告的所有已知編碼變體的外顯子組芯片，可能會(huì)提高識(shí)別與疾病狀態(tài)相關(guān)的罕見(jiàn)和常見(jiàn)等位基因患者突變負(fù)荷的效率，盡管它們也可能具有有限的臨床有效性39。

結(jié)構(gòu)和染色體變異的基因檢測(cè)

賊近化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步極大地提高了細(xì)胞遺傳學(xué)的分辨率，賊顯著的是開(kāi)發(fā)了多探針熒光原位雜交（FISH）和染色體CGH。撇開(kāi)經(jīng)濟(jì)因素不談，細(xì)胞遺傳學(xué)方法在臨床上逐漸被淘汰，取而代之的是SNP陣列CGH方法，該方法使用探針檢測(cè)染色體和基因組重排，以及比FISH更正確、更小的基因組變異。根據(jù)設(shè)計(jì)和探針密度，陣列CGH可以提供從整個(gè)染色體到大小為幾千個(gè)堿基的缺失和復(fù)制的檢測(cè)正確度。陣列CGH提高了重排檢測(cè)的靈敏度（平衡反轉(zhuǎn)和易位除外）和檢測(cè)單親二體（UPD）的能力，其不能通過(guò)染色體CGH檢測(cè)到。與此同時(shí)，分辨率的提高伴隨著亞顯微基因組重排檢測(cè)的大量增加，這些重排對(duì)受試患者的臨床表型的重要性尚不清楚。使用Ensembl資源（DECIPHER）的人類染色體不平衡和表型數(shù)據(jù)庫(kù)和細(xì)胞基因組陣列國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)（ISCA聯(lián)合會(huì)）等資源正在對(duì)可能影響劑量敏感基因拷貝數(shù)或破壞正?；虮磉_(dá)、導(dǎo)致疾病的亞微觀缺失和復(fù)制進(jìn)行分類列表。這些數(shù)據(jù)庫(kù)提供了一個(gè)共同的庫(kù)，用于幫助解釋診斷學(xué)中發(fā)現(xiàn)的往往新穎且往往是從頭開(kāi)始的結(jié)構(gòu)變化。即便如此，保存的表型數(shù)據(jù)的不均勻?qū)Υ祟悢?shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)用性構(gòu)成了重大限制。

同時(shí)，其他分子技術(shù)在檢測(cè)不同大小和復(fù)雜度的亞染色體重排的能力方面也有了指數(shù)級(jí)的提高。Southern印跡法曾廣泛用于結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）進(jìn)行分子診斷，但現(xiàn)在繼續(xù)用于檢測(cè)小的遺傳變化以及不適合PCR擴(kuò)增的大重復(fù)變異（例如，F(xiàn)MR1擴(kuò)增）。然而，賊近，多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA）分析已在某些應(yīng)用中取代了Southern印跡法。除了標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)變異（CNV），MLPA可以檢測(cè)鑲嵌突變以及甲基化狀態(tài)。此外，MLPA可以用于確認(rèn)FISH或CGH檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)異常。然而，在大多數(shù)情況下，MLPA不能檢測(cè)到平衡的基因組重排，如易位或倒位，這是一個(gè)很大的限制，考慮到人類遺傳疾病中這些類型的事件的出現(xiàn)。佳學(xué)基因預(yù)計(jì)，對(duì)于某些類型的遺傳損傷，如大三核苷酸擴(kuò)增，經(jīng)典的分子方法，包括Southern印跡和MLPA，仍將是先進(jìn)的檢測(cè)方法。

全基因組和全外顯子組測(cè)序基因檢測(cè)

NGS使用強(qiáng)大的大規(guī)模并行測(cè)序分析對(duì)許多感興趣的基因進(jìn)行測(cè)序，包括各種罕見(jiàn)和復(fù)雜疾病的全外顯子組或全基因組?；蚪M測(cè)序前的靶向外顯子捕獲（即WES）有助于對(duì)基因組的大多數(shù)編碼區(qū)進(jìn)行有效分析，而WGS評(píng)估了幾乎所有的人類基因組的常染色區(qū)（需要注意的是，在讀取長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)以解析重復(fù)密集區(qū)之前，異色區(qū)將在一段時(shí)間內(nèi)保持禁區(qū)）。WES已被證明是一種快速、正確的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致孟德?tīng)栁蓙y的某些突變的方法?；蚪M測(cè)序成本的大幅下降使某些候選基因的試劑成本低于桑格測(cè)序的成本（這對(duì)于重點(diǎn)基因組尤其如此），使WES和WGS的應(yīng)用經(jīng)濟(jì)可行。目前，WGS在臨床上不可用，但可從選定的臨床實(shí)驗(yàn)室獲得WES。臨床WES的解釋是有限的，幾乎沒(méi)有可用于臨床的報(bào)告結(jié)果。然而，各大學(xué)術(shù)中心的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家現(xiàn)在經(jīng)常為原因不明的遺傳疾病提供咨詢并要求進(jìn)行WES。雖然這兩種技術(shù)之間的選擇主要是由成本決定的，至少在資金充足的領(lǐng)域，WGS將在未來(lái)幾年取代WES。自然，與每一種顛覆性技術(shù)一樣，WGS數(shù)據(jù)將對(duì)WES提出新的挑戰(zhàn)，即解釋可能導(dǎo)致患者表型遺傳負(fù)荷的非編碼變體。

在某些情況下，可以采用基于疑似綜合征的靶向NGS方法，以賊小化成本并賊大限度地識(shí)別變異。

除了在WES和WGS中用于診斷和發(fā)現(xiàn)外，NGS還可用于檢測(cè)甲基化狀態(tài)、選擇性剪接、小RNA、等位基因特異性表達(dá)，甚至單倍型和重排。盡管NGS尚未有效用于WES和WGS以外的應(yīng)用，但NGS可能成為一系列其他“組學(xué)”應(yīng)用的強(qiáng)大平臺(tái)。

盡管有成本方面的考慮，但在臨床環(huán)境中使用WES和WGS的主要實(shí)際障礙是該技術(shù)高效檢測(cè)突變?nèi)笔Щ虼嬖诘哪芰τ邢?。不同的測(cè)序平臺(tái)已被證明提供的是質(zhì)量可變的結(jié)果，一些儀器在單個(gè)堿基調(diào)用時(shí)更正確，其他儀器覆蓋更廣泛的基因組，與WGS相比，包括特定基因組和整個(gè)外顯子組可能具有更高的分析敏感性（即，它們具有更好的檢測(cè)雜合變化的目標(biāo)覆蓋率），但限制了臨床敏感性，這可能會(huì)將解釋范圍限制在編碼病變。即使如此，目前也不可能從整個(gè)人類基因組，甚至是常染色體基因組中獲得高質(zhì)量的序列，這足以進(jìn)行詳盡的臨床解釋。

此外，為了有效地分析測(cè)序數(shù)據(jù)，WES和WGS診斷工作通常包括先證者和三人組中未患病的父母的測(cè)序，以在有關(guān)遺傳模式的有限信息下有效地確定從頭和遺傳突變。由于目前的WES臨床試驗(yàn)對(duì)從頭和先前報(bào)告的變異的解釋有限，一些臨床WES實(shí)驗(yàn)室僅對(duì)先證者進(jìn)行排序，并在父母基因信息中確認(rèn)目標(biāo)變異。盡管如此，獲得生物親屬在解釋遺傳變異方面仍然很有價(jià)值。為了進(jìn)一步完善大量數(shù)據(jù)，先證者和家庭成員的桑格測(cè)序確認(rèn)測(cè)試是典型的。佳學(xué)基因認(rèn)為，隨著市場(chǎng)力量和臨床需求推動(dòng)該領(lǐng)域向前發(fā)展，WES和WGS的技術(shù)挑戰(zhàn)將得到解決。然而，仍然存在嚴(yán)重的解釋問(wèn)題，這取決于初始基因組分析的范圍。

綜上所述，這些技術(shù)的經(jīng)濟(jì)和分析限制將限制WES和WGS成為鑒別診斷中有吸引力的第一步，需要二次確認(rèn)，并可能在一段時(shí)間內(nèi)通過(guò)其他方法進(jìn)行平行測(cè)試。