【佳學(xué)基因檢測】采用全外顯子組測序?qū)?a href='http://npz842.cn/cp/shengzhi/' target='_blank'>不孕不育中的巨精子癥進行致病基因鑒定基因檢測

遺傳病、罕見病基因檢測

精子癥是一種與男性不育癥相關(guān)的罕見精子形態(tài)異常，其特征是高比例的精子頭部不規(guī)則。采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測的目的是確定導(dǎo)致巨精子癥不育男性的基因原因。

采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測方法

用患者及其父母的外周血基因組 DNA 進行全外顯子組測序 (WES)通過基因解碼在眾多突變體中找出致病基因突變。

采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測結(jié)果

來自近親家庭的巨精子癥患者進行 WES 分析后，可以在 AURKC 基因 (c.269G>A) 中鑒定出一個新的純合錯義變異體。生物信息學(xué)分析也表明這種變異是一種致病突變。定量實時 PCR 分析表明，與他的父親相比，患者 AURKC 的 mRNA 水平顯著降低。此外，ICSI 后無法移植胚胎。

采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測結(jié)論

些結(jié)果進一步支持 AURKC 在男性不育癥中的重要作用，并指導(dǎo)醫(yī)生為巨精子癥患者做出賊佳決策。

采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測關(guān)鍵詞：

精子癥，AURKC，輔助生殖技術(shù)，全外顯子組測序
 

球約有 7000 萬對夫婦患有不孕癥，其中約一半是由男性因素造成的。巨精子癥是一種與男性不育癥相關(guān)的罕見精子形態(tài)異常，其特征是高比例的精子頭部不規(guī)則。這種綜合征于 1977 年新穎報道，影響不到 1% 的不育男性。它被認為是一種常染色體隱性遺傳類型的畸形精子癥，可導(dǎo)致男性不育。目前，已在巨精子癥患者中發(fā)現(xiàn)的賊相關(guān)的單基因缺陷是極光激酶 C ( AURKC ) 的突變。
AURKC基因編碼高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，該家族在中心體功能、同源染色體分離和減數(shù)分裂期間的胞質(zhì)分裂中起著至關(guān)重要的作用。到目前為止，只有五個AURKC突變被描述為與巨精子癥相關(guān)：c.144delC (p.L499Wfs22)、c.744C>G (p.Y248*)、c686G>A (p.C229Y)、c.930 +38G>A（發(fā)生在 3′-UTR）和 c.436-2A>G（導(dǎo)致外顯子 5 跳躍的剪接位點突變）。人類的這些突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能降低，導(dǎo)致減數(shù)分裂失敗，但精子發(fā)生不受影響，導(dǎo)致大頭精子的產(chǎn)生。
在這里，采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測報告了通過全外顯子組測序鑒定的來自近親家庭的不育男性的AURKC基因中的一種新型純合錯義變異。此外，根據(jù)基因解碼分析，該變體具有很高的致病概率。還進行了 ICSI，但未能生成任何適合移植的胚胎。這些結(jié)果進一步支持了AURKC在男性不育癥中的重要作用，并指導(dǎo)醫(yī)生為巨精子癥患者做出賊佳決策。
 

病人

證者是一名在佳學(xué)基因合作醫(yī)院接受不孕癥治療的 27 歲女性?；颊哒煞虻木簷z查結(jié)果見表1。 結(jié)果顯示，該患者患有巨精子癥（接近 100% 的大頭精子，精子數(shù)為 1 M/ml）。按照佳學(xué)基因不孕不育癥標(biāo)準(zhǔn)問詢表，得知患者丈夫的的父母為一級表親（圖 1）?；颊弑憩F(xiàn)出正常的勃起和射精，并報告每周性交 2-3 次；然而，他的妻子自2015年結(jié)婚以來一直無法懷孕?；颊邲]有不健康的活動或接觸不良化學(xué)物質(zhì)的歷史。體檢示男性外生殖器發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸大小正常，雙側(cè)精索靜脈觸診無異常。先證者沒有原發(fā)性小頭畸形或呼吸道疾病?；颊呷旧w核型正常（46；XY），Y染色體未見缺失。患者激素水平正常。

表1：患者射精的精子參數(shù)和形態(tài)

基因組 DNA 提取和全外顯子組測序 (WES)

據(jù)試劑盒生產(chǎn)者的方案，使用 QIAamp DNA blood midi 試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從外周血樣本中提取患者及其父母的基因組 DNA。

證者及其父母的基因組 DNA 接受了基于全基因組的的全外顯子測序分析。全外子組基因測序基因檢測由佳學(xué)基因在在 HiSeq2000 測序平臺（Illumina，San Diego，CA，USA）上進行。移除序列接頭后，使用 Burrows-Wheeler 比對器將全外顯子組測序測序數(shù)據(jù)與參考基因組 Hg19 比對，然后移除 PCR 重復(fù)項。使用 SAMtools 識別包括單核苷酸多態(tài)性和插入缺失在內(nèi)的變體，并通過 ANNOVAR 軟件進行注釋。候選基因被認為是滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的變體：(i) 錯義、無意義、移碼和剪接位點變體，(ii) 在兩個數(shù)據(jù)庫（dbSNP，1000G）中不存在或罕見（頻率低于 1%）， (iii) 患者的純合子變異及其父母的雜合子變異。

Sanger測序驗證

用 Sanger 測序驗證了先證者及其父母的 AURKC 突變。我們使用特定引物（正向引物為 5'-AACCAGGATTCGAGTGTCTG-3'，反向引物為 5'-CAATCTCCAGGTAGACGATGGAG-3'）擴增 AURKC 基因外顯子 3 的 PCR 產(chǎn)物。然后，在 ABI 3730XL 自動測序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA，USA）上對 PCR 產(chǎn)物進行測序。

RNA提取和Q-PCR

用制造商的方案使用 TRI REAGENT® BD（分子研究中心）對全血進行 RNA 提取。用 5 μl 提取的 RNA 在患者及其父母身上進行逆轉(zhuǎn)錄。oligo-dT 的雜交通過在 42°C 下孵育 30 分鐘并使用以下混合物在冰上淬滅來進行：5 μl RNA、10 μl 2Xsupermix（10 mM，Pharmacia）、1 μl gDNA（0.5 mM， Roche 診斷）和 4 μl H 2 O。然后使用 StepOne-PlusTM 實時 PCR 系統(tǒng)（Life Technologies）和 Power SYBR Green PCR，將 2 μl 獲得的 cDNA 混合物用于定量 PCR（Q-PCR） Master Mix (Life Technologies) 根據(jù)制造商的協(xié)議?；虮磉_倍數(shù)變化的定量是通過相對定量法 (2−ΔΔCT ) 使用gapdh基因作為參考。數(shù)據(jù)顯示為平均值的平均倍數(shù)增加標(biāo)準(zhǔn)誤差。補充文件 1中描述了引物。

ICSI、胚胎和胚胎質(zhì)量評價

患者及其妻子在佳學(xué)基因合作醫(yī)院接受了胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）。簡而言之，根據(jù)試劑生產(chǎn)商的說明，使用 Vitrolife G-SERIES™ 培養(yǎng)基（Vitrolife，瑞典哥德堡）進行胚胎培養(yǎng)?；颊叩钠拮咏邮芰艘粋€ ICSI 周期。“結(jié)果”部分描述了詳細結(jié)果。

AURKC 蛋白的序列比對

用 ClustalX2.1 對不同物種的 AURKC 蛋白進行序列比對。每個物種的相應(yīng)分子代碼如下：Homo sapiens ( NP_001015878.1 ), Mus musculus ( AAI00338.1 ), Bos Taurus ( NP_001180124.1 ), Desmodus rotundus ( XP_024425801.1 ), Pan paniscus ( XP_003816716.1 ), Pongo abelii ( XP_002829903.1 ) 和褐家鼠( NP_001295465.1 )。

一例巨精子癥患者的WES分析

了確定引起巨精癥的來自基因序列變化的遺傳原因，男性不孕癥基因解碼基因檢測使用患者及其父母的外周血基因組 DNA 進行了男性不孕癥致病基因鑒定基因解碼基因檢測，以確定可能存在的致病突變?？紤]到血緣家族史，基因解碼過程中首先關(guān)注純合突變。在排除頻繁基因突變和應(yīng)用技術(shù)和生物過濾器之后，建立了有限的純合突變列表。為了確定這 36 個基因中的任何一個是否與巨精癥有關(guān)，基因解碼首先檢查了每個基因的組織表達模式。在這些純合變異基因中，只有兩個基因表現(xiàn)出睪丸富集表達。已鑒定的基因之一是 AURKC，基于基因解碼的全外顯子測序基因檢測在患者的外顯子 3 中鑒定出一個新突變（c.269G>A，GenBank 登錄號，NM_001015878）。因此，氨基酸的變化被確定為Arg90Gln。另一個已鑒定的基因是配子發(fā)生素 ( GGN ) ，這個基因發(fā)生的突變是c.148T>C，GenBank 登錄號，NM_152657.3。 在外顯子 3 中被 WES 在患者中鑒定出來。因此，氨基酸的變化被確定為Trp50Arg。

圖 2：近親家族的全外顯子組測序分析。A本研究中使用的過濾策略。B受影響患者及其父母的 Sanger 測序驗證。箭頭表示突變位點?；颊呒捌涓赣HAURKC mRNA 表達的C Q-PCR 分析。通過 Q-PCR 確定的信使 RNA 表達計算為相對于gapdh的比率，并相對于他的父親表達。D不同物種中 AURKC 蛋白的序列比對。箭頭指的是突變位點

通過 Sanger 測序驗證

們接下來進行了 Sanger 測序，以驗證患者及其父母AURKC和GGN基因的純合變異。使用 PCR 從患者及其父母的基因組 DNA 中擴增AURKC基因的外顯子 3 。AURKC中的純合錯義變異在該患者中得到驗證，并且他的父母具有雜合等位基因（圖 2B）。

AURKC中已識別變體的不利影響

幸的是，我們無法獲得受影響患者及其父母的睪丸活檢樣本；因此，我們建立了 Q-PCR 來研究變異的影響。Q-PCR 分析表明，AURKC 的 mRNA 水平在患者中顯著下調(diào)（圖 2C）。

突變的計算機分析

過三種在線致病性預(yù)測工具（Polyphen-2、SIFT、Mutation taster）對 AURKC 基因中 c.269G>A 突變的生物信息學(xué)分析表明，該突變很可能是致病突變。此變體是 ExAC、1000G 和 gnomAD 數(shù)據(jù)庫中不存在的新突變。R90 的突變位點從人類到斑馬魚高度保守，表明該位點對 AURKC 蛋白的功能具有重要作用（圖 2D）。

CSI 使用患者的精子

密度梯度離心和仔細檢查后，選擇了一些適合 ICSI 微量移液器的“外觀正常”的精子。在佳學(xué)基因檢測合作醫(yī)院為患者嘗試了一個 ICSI 周期。對于 ICSI 周期，我們收集了 10 個卵子和 7 個 MII 卵母細胞；沒有一個胚胎發(fā)育到胚泡階段。
 

過去十年中，五個突變（c.144delC (p.L49Wfs22)、c.744C>G (p.Y248*)、c686G>A (p.C229Y)、c.930+38G>A（發(fā)生在 3 ′-UTR) 和 c.436-2A>G（導(dǎo)致外顯子 5) 跳躍的剪接位點突變）在AURKC基因中已被報道與巨精癥有關(guān)。在這項研究中，我們在來自近親家庭的患者的AURKC基因中發(fā)現(xiàn)了一個新的純合突變 (c.269 G>A; p.R90Q) 。對患者進行了一個 ICSI 周期，但沒有一個胚胎發(fā)育到囊胚階段。

今為止，大量報告提供的證據(jù)表明，在先進次、第二次或兩次減數(shù)分裂期間染色體分離和/或胞質(zhì)分裂失敗是巨精子癥的主要原因 。Aurora 激酶是進化上高度保守的激酶，是減數(shù)分裂過程中正確的染色體分離和胞質(zhì)分裂所必需的 。AURKC有 7 個外顯子，編碼人類 309 個氨基酸的蛋白質(zhì)。AURKC是極光激酶家族的一個組成部分，主要在睪丸中表達。在采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測，佳學(xué)基因在AURKC的外顯子 3 中發(fā)現(xiàn)了一個新的錯義突變導(dǎo)致氨基酸變化的基因 (p.R90Q)。AURKC 蛋白的序列比對表明，該突變位點在不同物種中是保守的（圖2C）。

用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測利用三種在線致病性預(yù)測工具（Polyphen-2、SIFT、Mutation taster）來預(yù)測該變異的危害性（表 2）。結(jié)果表明，該變異具有很高的致病概率。

前的研究比較了有和沒有AURKC突變的患者的常規(guī)精液圖和精細胞圖的值。結(jié)果表明，大頭精子的比例普遍達到了更高的值，1% 的正常精子的存在是AURKC突變患者中賊具鑒別力的參數(shù)。與之前的研究一致，采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測中AURKC基因錯義變異（c.269G>A）的患者顯示 96% 的大頭精子。然而，正常精子的比例達到了4%。一種解釋可能是，除了巨精子癥，這里研究的這名患者的精子數(shù)量也很低 (1.71 × 10 6). 操作員和實驗室之間對正常精子特征的可變評分也可能影響結(jié)果，因為一些頭部或鞭毛具有輕微形態(tài)缺陷的精子可以被認為是正常的。

多研究描述了巨精子癥患者的妊娠失敗。此外，進一步的研究建議，當(dāng)患者頭部精子增大超過 30% 時，應(yīng)進行 AURKC 基因的系統(tǒng)遺傳篩查。如果發(fā)現(xiàn)AURKC基因突變，則不應(yīng)嘗試 ICSI 。在這項研究中，患者的妻子在一個 ICSI 周期后未能懷孕，再次證明了AURKC與基因突變和 ICSI 結(jié)果。因此，不推薦對此類患者進行 ICSI。

之，采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測在 AURKC 基因中發(fā)現(xiàn)了一個新的錯義突變 (c.269 G>A; p.R90Q)。迄今為止，這是與巨精子癥相關(guān)的 AURKC 基因的第六個報告變體。采用全外顯子組測序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進行致病基因鑒定基因檢測擴大了 AURKC 突變的范圍，有助于指導(dǎo)從業(yè)者為巨精子癥患者做出賊佳決策。