【佳學(xué)基因檢測(cè)】唇裂基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展與應(yīng)用

唇裂（Cleft Lip）是一種常見(jiàn)的先天性顱面畸形，通常分為非綜合征性唇裂伴腭裂（NSCLP）和非綜合征性單純唇裂（NSCLO）。近年來(lái)，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，唇裂基因檢測(cè)技術(shù)更新團(tuán)隊(duì)能夠更深入地唇裂致病基因鑒定基因解碼唇裂的遺傳背景，從而為疾病的早期診斷、預(yù)防和個(gè)體化治療提供新思路。《唇裂發(fā)生的原因查找與跟蹤》將介紹唇裂的基因檢測(cè)技術(shù)及其在唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應(yīng)用中的進(jìn)展。

樣本收集與唇裂致病基因鑒定基因解碼背景

在唇裂基因檢測(cè)的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，樣本的收集和分析是關(guān)鍵的第一步。唇裂基因檢測(cè)技術(shù)更新團(tuán)隊(duì)在2017年至2019年期間招募了159例NSCL/P患者，其中包括79例NSCLP和80例NSCLO患者，這些患者均在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院接受手術(shù)治療。此外，還收集了542名未受影響的對(duì)照組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來(lái)自于佳學(xué)基因致病基因鑒定基因解碼的全基因組測(cè)序（WGS）數(shù)據(jù)，覆蓋度為39.89×。在隨后的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，唇裂基因檢測(cè)技術(shù)更新團(tuán)隊(duì)又在2004名NSCL/P患者和1823名對(duì)照組中進(jìn)行了一輪重要單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的復(fù)制唇裂致病基因鑒定基因解碼，并在1729名NSCL/P患者、995名非綜合征性腭裂（NSCPO）患者和996名健康對(duì)照中進(jìn)行了第二輪復(fù)制唇裂致病基因鑒定基因解碼。所有參與者均為漢族人群。

為了確保唇裂致病基因鑒定基因解碼的倫理合規(guī)性，所有參與者或其監(jiān)護(hù)人均簽署了知情同意書。該唇裂致病基因鑒定基因解碼獲得了四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)（WCHSIRB-D-2018-012R1）的批準(zhǔn)，并遵循《流行病學(xué)觀察性唇裂致病基因鑒定基因解碼報(bào)告強(qiáng)化標(biāo)準(zhǔn)》（STROBE）指南。

目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序準(zhǔn)備與實(shí)施

基因選擇與目標(biāo)區(qū)域

唇裂致病基因鑒定基因解碼人員根據(jù)中國(guó)漢族（CHB）和日本（JPT）人群的HapMap連鎖不平衡（LD）結(jié)構(gòu)，選擇了位于IRF6基因周圍的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。具體選擇了位于染色體1的209,923,704至210,382,027（Hg19）區(qū)域，長(zhǎng)度為458.323 kb，涵蓋了IRF6基因的編碼和非編碼區(qū)域。

測(cè)序文庫(kù)的制備

為了有效捕獲和富集目標(biāo)區(qū)域的基因片段，唇裂致病基因鑒定基因解碼團(tuán)隊(duì)使用了Agilent液相捕獲系統(tǒng)（Agilent SureSelectXT Custom Kit）。具體步驟如下：

1. 基因組DNA片段化：使用Covaris粉碎儀將1.0 μg基因組DNA樣本剪切成180至280 bp的片段。
2. 文庫(kù)構(gòu)建：進(jìn)行末端修復(fù)和A尾添加，然后將特異性索引接頭連接到片段兩端，以制備DNA文庫(kù)。
3. 目標(biāo)區(qū)域捕獲：將DNA文庫(kù)與生物素標(biāo)記的探針雜交，并通過(guò)含鏈霉素的磁珠捕獲目標(biāo)區(qū)域。
4. PCR擴(kuò)增與質(zhì)量檢測(cè)：對(duì)捕獲區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，并進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)。
5. 高通量測(cè)序：最終在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)上進(jìn)行雙端150 bp的測(cè)序。

基因分型與統(tǒng)計(jì)分析

基因分型技術(shù)

在復(fù)制唇裂致病基因鑒定基因解碼中，選擇的SNPs通過(guò)SNPscan方法進(jìn)行基因分型，該方法基于雙連接和多重?zé)晒釶CR。為確?；蚍中偷臏?zhǔn)確性，隨機(jī)選擇了4%的樣本進(jìn)行重復(fù)分析。

統(tǒng)計(jì)分析

使用PLINK軟件對(duì)SNP進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢驗(yàn)、關(guān)聯(lián)分析、單體型關(guān)聯(lián)的滑動(dòng)窗口分析和條件邏輯分析。唇裂基因檢測(cè)技術(shù)更新團(tuán)隊(duì)從發(fā)現(xiàn)階段選擇了5個(gè)顯著的SNPs進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)制唇裂致病基因鑒定基因解碼，選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：

1. 最小次等位基因頻率：GnomAD_EAS_AF和1000基因組_EAS≥0.3。
2. 連鎖不平衡區(qū)塊：根據(jù)1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CHS&CHB連鎖不平衡區(qū)塊，選擇標(biāo)記SNPs以最大限度地覆蓋所有顯著的SNPs。

經(jīng)過(guò)Bonferroni多重校正，目標(biāo)測(cè)序階段的關(guān)聯(lián)分析P值顯著性閾值為4.59E-05，第一輪復(fù)制Prep1為0.0033，第二輪復(fù)制Prep2和綜合P值Pcomb為0.0042。使用Haploview計(jì)算成對(duì)連鎖不平衡，同時(shí)根據(jù)以下公式計(jì)算人群歸因風(fēng)險(xiǎn)百分比（PAR%）：PAR% = [Pe (RR − 1) / RR] × 100（Pe為病例中等位基因的流行率，RR為相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)；比值比OR用作RR的代理）。

定量實(shí)時(shí)PCR分析

在進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，唇裂致病基因鑒定基因解碼人員收集了54名NSCLO和32名微型唇裂（MCL）患者的唇部組織樣本，這些樣本是在患者約1歲時(shí)進(jìn)行唇裂修復(fù)手術(shù)時(shí)收集的。樣本總RNA使用RNA-easy Isolation Reagent（Vazyme）提取，并使用PrimeScript RT試劑盒和TB Green Fast qPCR混合物（Takara）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA和進(jìn)一步的定量實(shí)時(shí)PCR（RT-qPCR）分析。最終，使用GAPDH作為參考基因，通過(guò)2–ΔΔCt方法分析IRF6的相對(duì)表達(dá)水平。

基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用與展望

基因檢測(cè)的應(yīng)用

唇裂的基因檢測(cè)技術(shù)不僅在基礎(chǔ)唇裂致病基因鑒定基因解碼中具有重要意義，也在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力：

• 早期診斷：通過(guò)基因檢測(cè)，可以在嬰兒出生前識(shí)別出唇裂的風(fēng)險(xiǎn)，為早期干預(yù)提供機(jī)會(huì)。
• 個(gè)體化治療：了解患者的基因變異有助于制定個(gè)性化治療方案，提高治療效果。
• 遺傳咨詢：基因檢測(cè)結(jié)果可為家族提供遺傳咨詢，幫助家族成員了解自身和后代患病風(fēng)險(xiǎn)。

唇裂致病基因鑒定基因解碼進(jìn)一步提升計(jì)劃

盡管基因檢測(cè)在唇裂風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中顯示出巨大潛力，但仍面臨一些挑戰(zhàn)：

• 準(zhǔn)確性和可靠性：基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性需要在不同人群中進(jìn)行驗(yàn)證。
• 倫理和隱私問(wèn)題：基因檢測(cè)涉及倫理和隱私問(wèn)題，需要妥善處理。
• 跨學(xué)科合作：基因檢測(cè)的進(jìn)展需要生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和數(shù)據(jù)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科的緊密合作。

總之，唇裂基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為疾病的早期診斷、預(yù)防和個(gè)體化治療提供了新的可能。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和唇裂致病基因鑒定基因解碼的深入，基因檢測(cè)將在唇裂的預(yù)防和治療中發(fā)揮更大作用。通過(guò)進(jìn)一步的唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應(yīng)用，基因檢測(cè)將為患者和家庭帶來(lái)更多的益處。