【佳學基因檢測】scRNAseq在基因解碼、基因檢測中的作用

scRNAseq導(dǎo)讀

scRNAseq是一種基因解碼技術(shù)，其主要作用在于可以揭示過去被認為是單一生理過程、單一組織的異質(zhì)性。佳學基因等基因信息分析機構(gòu)利用單細胞測序可以將人體基因序列的變化與人體的發(fā)育過程、生理過程和病理過程的調(diào)節(jié)方式和調(diào)節(jié)途徑的揭示。是否采用了單細胞測序結(jié)果用于指導(dǎo)致病基因的鑒定是基因解碼與基因檢測的又一個本質(zhì)區(qū)別。

單細胞測序可以揭示哪些基因檢測不能提供的結(jié)果？

人類各種組織之間細胞的類型，狀態(tài)和相互作用差異巨大。而單細胞RNA測序（snRNA-seq）技術(shù)提供了在單細胞水平觀測基因表達的方法，可以更好地研究這些組織及其中存在的不同類型的細胞。

這一先進且激動人心的技術(shù)可被用于：

研究一個組織中到底存在哪些種類的細胞

識別未知或少見的細胞類型或狀態(tài)

闡明在分化過程或時間及狀態(tài)變化中基因表達的改變

找出在不同條件下（如加藥組和疾病組）在某一特定類型的細胞中差異表達的基因

探究一種細胞類型之間基因表達的變化，同時納入空間，調(diào)控和/或蛋白質(zhì)信息

單細胞測序中解決一些較常見問題的方法包括：

單細胞RNA測序分析中面臨的挑戰(zhàn)

在單細胞RNA測序（scRNA-seq）出現(xiàn)之前，轉(zhuǎn)錄組分析是使用批量RNA測序（bulk RNA-seq）進行的，這是一種比較細胞基因表達平均值 (averages of cellular expression)的直接方法。如果要尋找疾病的生物學標志物 (disease biomarkers)，或者不關(guān)心樣本中的細胞異質(zhì)性，這可能是賊好的方法。

雖然批量RNA測序可以探索不同條件（如加藥或疾病）之間基因表達的差異，但在細胞水平上的差異并沒有被充分挖掘。例如，在下圖的展示中，如果進行批量（bulk）分析（左），我們將無法檢測到基因A和基因B表達之間的正確關(guān)系。但是，如果我們按照細胞類型或細胞狀態(tài)對細胞進行適當分群，我們可以看到基因之間的正確關(guān)系。

探究異質(zhì)性 (Studying heterogeneity)

譜系路徑分析 (Lineage tracing study)

隨機基因表達研究 (Stochastic gene expression study)

盡管單細胞RNA測序能夠獲得在細胞水平上的基因表達，但樣本制備和建庫成本更高，分析也更復(fù)雜，更難解讀。單細胞RNA測序分析的復(fù)雜性包括：

數(shù)據(jù)量巨大

每個細胞測序深度低

跨細胞/樣本的生物學誤差

跨細胞/樣本的技術(shù)性誤差

數(shù)據(jù)量巨大

單細胞RNA測序項目的表達量數(shù)據(jù)代表了成千上萬個細胞中上萬或數(shù)十萬條讀取 (reads)，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)要大得多，需要更多的內(nèi)存來分析，更大的硬盤來存儲，以及更多的時間來運行分析。

每個細胞測序深度低

對于基于油滴（droplet）的單細胞RNA測序方法，測序的深度較淺，通常每個細胞只能檢測到10-50%的轉(zhuǎn)錄組。這導(dǎo)致細胞中許多基因顯示為零計數(shù)。然而，在一個特定的細胞中，一個基因的零計數(shù)可能意味著該基因沒有被表達，或者只是沒有檢測到轉(zhuǎn)錄本。在細胞中，表達水平較高的基因往往具有較少的零計數(shù)。由于這一特性，許多基因在任何細胞中都不會被檢測到，細胞間的基因表達也會有很大的差異。

跨細胞/樣本的生物學誤差

我們不感興趣的生物學變異會導(dǎo)致細胞間的基因表達跟實際的生物細胞類型或狀態(tài)更為相似或不同，從而影響細胞類型的識別。這些生物學變異（除非是實驗研究的一部分）包括：

轉(zhuǎn)錄脈沖 (Transcriptional Bursting)：并非所有基因的基因轉(zhuǎn)錄都處于開啟狀態(tài)。捕獲時間點將決定每個細胞中的基因是打開還是關(guān)閉狀態(tài)。

RNA加工的不同速度 (Varying rates of RNA processing)：不同的RNA以不同的速率進行加工。

連續(xù)或離散的細胞特征 (Continuous or discrete cell identities)：例如單個T細胞的促炎癥潛能。連續(xù)的表型通過基因表達上的變化來定義，有時很難區(qū)分表型是連續(xù)的，還是離散的。

環(huán)境刺激 (Environmental stimuli)：細胞的周邊環(huán)境可以通過空間位置、信號分子等方式影響基因的表達。

時序改變 (Temporal changes)：基本的細胞時序變化過程，例如細胞周期，可以影響單個細胞的基因表達譜。

跨細胞/樣本的技術(shù)性誤差

技術(shù)來源的變異會導(dǎo)致細胞間的基因表達因技術(shù)來源而變得更相似/不同，而不是細胞類型/狀態(tài)，這會影響細胞類型的識別。技術(shù)來源的變異包括：

不同細胞的捕獲效率 (Cell-specific capture efficiency)：不同細胞捕獲的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量不同，導(dǎo)致測序深度不同（例如，轉(zhuǎn)錄組的10-50%）。

文庫質(zhì)量 (Library quality)：降解的RNA、低活性/瀕死的細胞、大量游離的RNA、分離不好的細胞以及細胞定量不正確都會導(dǎo)致測序質(zhì)量過低。

擴增偏差 (Amplification bias)：在建庫（library preparation）的擴增步驟中，并非所有的轉(zhuǎn)錄本都被擴增到相同的水平。

批次差異 (Batch effects)：批次問題是單細胞RNA分析中的一個重要問題，因此你可以看到由于批次問題而導(dǎo)致的基因表達上的顯著差異。

如何知道你是否有批次問題？

所有的RNA提取都是在同一天進行的嗎？

所有的建庫工作都是在同一天進行的嗎？

所有樣品的RNA提取或建庫是否由同一個人完成？

你是否對所有樣品都使用了相同的試劑？

你是否在同一地點進行了RNA的提取或建庫？

如果這些答案中有一個是“不”，那么你就有批次問題。

有關(guān)批次問題的賊佳實踐

在實驗設(shè)計中盡可能地避免產(chǎn)生批次

如果無法避免批次：

不要混淆不同批次的實驗

請在不同批次中做不同類別樣品的重復(fù)（replicates）。如果是想找出不同處理條件下的差異基因或者在群體水平上下結(jié)論，重復(fù)自然越多越好（當然要大于2）。如果使用一次實驗只建庫一次的inDrops方法，則應(yīng)替換樣本組（例如，不要先建所有疾病組的文庫，然后再建所有治療組的文庫）。

總結(jié)

雖然單細胞RNA測序是一種強大而深刻的從單細胞水平分析基因表達的方法，但由于存在許多挑戰(zhàn)和變異因素，單細胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析顯得復(fù)雜且受限。

綜上所述，我們提出以下建議：

除非對解決我們感興趣的科學問題有必要，否則不要進行單細胞RNA測序。你是否能夠使用更簡單，更廉價的批量RNA測序解決你的科學問題？也許可以使用流式細胞儀（FACS）對樣本進行分選，以便進行批量分析？

了解你想解決的科學問題的各種細節(jié)。推薦的建庫方法和分析流程可以根據(jù)具體實驗而有所不同。

盡可能地避免技術(shù)來源的差異：

實驗開始前與專家討論實驗設(shè)計

同時從樣品中提取RNA

同時建庫或替換樣本組以避免批次混淆

不要混淆不同性別、年齡和批次的樣本組

(責任編輯：佳學基因)

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